Análise comparativa de lesões por meio de uma abordagem de sequenciamento direcionada
Summary
Este artigo descreve um método para identificar alterações clonais e subclonais entre diferentes espécimes de um determinado paciente. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem em um tipo específico de tumor, a abordagem é amplamente aplicável a outros tumores sólidos.
Abstract
Avaliar a heterogeneidade intratumoral (ITH) é de suma importância para antecipar o fracasso das terapias direcionadas e projetar estratégias antitumorais, portanto, eficazes. Embora as preocupações sejam freqüentemente levantadas devido a diferenças no processamento de amostras e profundidade de cobertura, o sequenciamento de tumores sólidos na próxima geração desvendou um grau altamente variável de ITH entre os tipos de tumores. A captura da relação genética entre lesões primárias e metastáticas através da identificação de populações clonais e subclonais é fundamental para o projeto de terapias para doenças em estágio avançado. Aqui, relatamos um método de análise comparativa de lesões que permite a identificação de populações clonais e subclonais entre diferentes espécimes do mesmo paciente. A abordagem experimental descrita aqui integra três abordagens bem estabelecidas: análise histológica, sequenciamento multilesário de alta cobertura e análises imunoestatísticas. A fim de minimizar os efeitos na detecção de eventos subclonais por processamento inadequado de amostras, submetemos os tecidos a examepatológico cuidadoso e enriquecimento de células neoplásticas. O DNA controlado por qualidade de lesões neoplásticas e tecidos normais foi então submetido a sequenciamento de alta cobertura, visando as regiões de codificação de 409 genes cancerígenos relevantes. Embora apenas olhando para um espaço genômico limitado, nossa abordagem permite avaliar a extensão da heterogeneidade entre alterações somáticas (mutações de nucleotídeo único e variações de número de cópia) em lesões distintas de um determinado paciente. Através da análise comparativa dos dados de sequenciamento, fomos capazes de distinguir alterações clonais versus subclonais. A maioria da ITH é frequentemente atribuída a mutações de passageiros; Portanto, também usamos imunohistoquímica para prever consequências funcionais das mutações. Embora este protocolo tenha sido aplicado a um tipo específico de tumor, prevemos que a metodologia descrita aqui é amplamente aplicável a outros tipos de tumores sólidos.
Introduction
O advento do sequenciamento da próxima geração (NGS) revolucionou a forma como os cânceres são diagnosticados e tratados1. NGS acoplado ao sequenciamento multi-regional têm exposto um alto grau de heterogeneidade intratumoral (ITH) em tumores sólidos2, o que explica em parte a falha da terapia direcionada devido à presença de subclones com sensibilidade medicamentosa diferente2 . Um desafio importante colocado pelos estudos de sequenciamento em todo o genoma é a necessidade de distinguir entre mutações de passageiros (ou seja, neutro) e motoristaem cânceres individuais3. Vários estudos têm mostrado de fato que, em certos tumores, as mutações dos passageiros são responsáveis pela maioria da ITH, enquanto as alterações do motorista tendem a ser conservadas entre lesões do mesmo indivíduo4. Também é importante notar que a grande carga mutacional (como visto em cânceres de pulmão e melanoma) não implica necessariamente uma grande carga mutacional subclonal2. Portanto, um alto grau de ITH pode ser encontrado em tumores com baixa carga mutacional.
Metástases são responsáveis por mais de 90% da morte relacionada ao câncer em todo o mundo5; Portanto, a captura da heterogeneidade mutacional dos genes condutores entre lesões primárias e metastáticas é fundamental para o projeto de terapias eficazes para doenças em estágio avançado. O sequenciamento clínico é geralmente realizado em ácidos nucleicos de tecidos fixos, o que torna a exploração em todo o genoma difícil por causa da má qualidade do DNA. Por outro lado, a intenção do sequenciamento clínico é identificar mutações e/ou mutações acionáveis que possam prever a capacidade de resposta/sem resposta a um determinado regime terapêutico. Tal como está, o sequenciamento pode ser restrito a uma fração menor do genoma para extração oportuna de informações clinicamente relevantes. A transição do perfil de DNA de baixa taxa de rendimento (por exemplo, sequenciamento de sanger) para ngs tornou possível analisar centenas de genes relevantes para o câncer em uma alta profundidade de cobertura, o que permite a detecção de eventos subclonais. Aqui, relatamos um método de análise comparativa de lesões que permite a identificação de populações clonais e subclonais entre diferentes espécimes do mesmo indivíduo. O método descrito aqui integra três abordagens bem estabelecidas (análise histológica, sequenciamento multilesário de alta cobertura e análises imunoestatísticas) para prever consequências funcionais das variações identificadas. A abordagem é descrita schemticamente na Figura 1 e tem sido aplicada ao estudo de 5 casos metastáticos de neoplasias pseudopapilares sólidos (SPNs) do pâncreas. Embora descrevamos o processamento e a análise de espécimes de tecidos embutidos em parafina (FFPE) fixados em formalina, o mesmo procedimento pode ser aplicado ao material genético do tecido fresco-congelado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso método permite a identificação de alterações moleculares envolvidas na progressão de tumores sólidos através da integração de dados verticais (ou seja, morfologia, sequenciamento de DNA e imunohistoquímica) a partir de lesões distintas de um determinado paciente. Demonstramos a capacidade de nosso método para detectar eventos clonais e subclonais em um tipo mutacional de tumor silencioso (ou seja, SPN, neoplasia pseudopapilar sólida do pâncreas) interrogando as sequências de codificação de 409 gen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado pelo Projeto Genoma do Câncer Italiano (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Subvenção nº 12182 à AS e 18178 ao VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac No 602783 à AS). As agências de financiamento não tiveram nenhum papel na coleta, análise e interpretação de dados ou na redação do manuscrito.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
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