Sammenlignende læsioner analyse gennem en målrettet sekvensering tilgang
Summary
Denne artikel beskriver en metode til at identificere klonale og subklonale ændringer blandt forskellige prøver fra en given patient. Selv om de eksperimenter, der er beskrevet her fokusere på en bestemt tumortype, tilgangen er stort set gælder for andre solide tumorer.
Abstract
Vurdering intra-tumoral heterogenitet (ITH) er af afgørende betydning for at foregribe svigt af målrettede terapier og design i overensstemmelse hermed effektive anti-tumor strategier. Selv om bekymringer er ofte rejst på grund af forskelle i prøve behandling og dybde dækning, næste generations sekvensering af solide tumorer har trævlet en meget varierende grad af ITH på tværs af tumortyper. Indfangning af den genetiske slægtskab mellem primære og metastatiske læsioner gennem identifikation af klonale og subklonale populationer er afgørende for udformningen af terapier for Advance-scene sygdomme. Her rapporterer vi en metode til komparativ læsioner analyse, der giver mulighed for identifikation af klonale og subklonale populationer blandt forskellige prøver fra den samme patient. Den eksperimentelle fremgangsmåde, der er beskrevet her, integrerer tre veletablerede tilgange: histologisk analyse, High-dækning multi-læsion sekventering, og immunophenotypic analyser. For at minimere virkningerne på påvisning af subklonale hændelser ved uhensigtsmæssig prøve behandling, underkastes vi væv til omhyggelig patologisk undersøgelse og neoplastisk celle berigelse. Kvalitetskontrolleret DNA fra neoplastiske læsioner og normalt væv blev derefter udsat for høj dæknings rækkefølge, som var rettet mod kodnings områderne for 409 relevante kræft gener. Mens vi kun ser på et begrænset genomområde, gør vores tilgang det muligt at evaluere omfanget af heterogenitet blandt somatiske ændringer (enkelt-nukleotidmutationer og kopi-nummer variationer) i særskilte læsioner fra en given patient. Gennem komparativ analyse af sekvensering data, vi var i stand til at skelne klonal vs. subklonale ændringer. Størstedelen af ITH tilskrives ofte passager mutationer; Derfor har vi også brugt immun histokemi til at forudsige funktionelle konsekvenser af mutationer. Mens denne protokol er blevet anvendt til en bestemt tumortype, vi forventer, at den metode, der er beskrevet her, er stort set gælder for andre solide tumortyper.
Introduction
Fremkomsten af næste generation sekventering (NGS) har revolutioneret den måde, kræft er diagnosticeret og behandlet1. NGS koblet til multiregional sekvensering har afsløret en høj grad af intra-tumoral heterogenitet (ITH) i solide tumorer2, hvilket i del forklarer svigt af målrettede terapi på grund af tilstedeværelsen af subkloner med forskellige stof følsomhed2 . En vigtig udfordring i forbindelse med genomundersøgelser er nødvendigheden af at skelne mellem passager (dvs. neutral) og driver mutationer i individuelle kræftformer3. Flere undersøgelser har faktisk vist, at i visse tumorer, passager mutationer tegner sig for størstedelen af ITH, mens føreren ændringer tendens til at blive bevaret blandt læsioner af den samme individuelle4. Det er også vigtigt at bemærke, at stor Mutations byrde (som det ses i lungekræft og melanom) ikke nødvendigvis indebærer en stor subklonal Mutations byrde2. Derfor kan en høj grad af ITH findes i tumorer med lav Mutations byrde.
Metastaser er ansvarlige for mere end 90% af cancerrelaterede dødsfald på verdensplan5; Derfor er det afgørende for udformningen af effektive terapier for avancerede sygdomme at opfange de mutationale heterogenitet af driver gener blandt primære og metastatiske læsioner. Klinisk sekvensering udføres generelt på nukleinsyrer fra fast væv, hvilket gør Genome-udforskning vanskelig på grund af dårlig DNA-kvalitet. På den anden side er hensigten med klinisk sekvensering at identificere handlingsrettede mutationer og/eller mutationer, der kan forudsige reaktionsevne/manglende respons på et givent terapeutisk regime. Som det ser ud, kan sekvensering begrænses til en mindre del af genomet til rettidig ekstraktion af klinisk relevante oplysninger. Overgangen fra DNA-profilering med lav gennemløb (f. eks. sanger sekvensering) til NGS har gjort det muligt at analysere hundredvis af kræft relevante gener ved en høj dæknings dybde, hvilket giver mulighed for påvisning af subklonale hændelser. Her rapporterer vi en metode til komparativ læsioner analyse, der giver mulighed for identifikation af klonale og subklonale populationer blandt forskellige prøver fra den samme person. Den metode, der er beskrevet her, integrerer tre veletablerede tilgange (histologisk analyse, multi læsions sekvensering med høj dækning og immunophenotypiske analyser) for at forudsige de funktionelle konsekvenser af de identificerede variationer. Fremgangsmåden er skematisk beskrevet i figur 1 og er blevet anvendt til studiet af 5 metastatiske tilfælde af solide pseudopapillær neoplasmer (SPN’er) i bugspytkirtlen. Mens vi beskriver behandling og analyse af formalin-faste paraffin indlejrede (FFPE) vævsprøver, kan den samme procedure anvendes på genetisk materiale fra fersk frosset væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores metode gør det muligt at identificere molekylære ændringer, der er involveret i progression af solide tumorer gennem integration af lodrette data (dvs. morfologi, DNA-sekvensering og immun histokemi) fra forskellige læsioner af en given patient. Vi demonstrerede evnen af vores metode til at opdage klonale og subklonale hændelser i en Mutations tavse tumortype (dvs. SPN, solid-pseudopapillær neoplasma i bugspytkirtlen) ved at forhør kodning sekvenser af 409 kræft relevante gener8. En …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev støttet af det italienske Cancer Genomprojekt (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; 12182 til AS og 18178 til VC), RP7 tilskud fra Det Europæiske Fællesskab (cam-Pac No 602783 til AS). Finansieringsorganerne havde ingen rolle i indsamlingen, analysen og fortolkningen af data eller i skrivningen af manuskriptet.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
