يتم تقديم بروتوكول لاعداد الثقافات شريحة العائمة الحرة من الدماغ البشري الكبار. البروتوكول هو اختلاف أسلوب الثقافة شريحة تستخدم علي نطاق واسع باستخدام ادراج غشاء. انها بسيطه ، وفعاله من حيث التكلفة ، وأوصيت لتشغيل اختبارات قصيرة الأجل تهدف إلى كشف أليات الضمور العصبي وراء امراض الدماغ المرتبطة بالعمر.
التنميط العضوي ، أو الثقافات الشريحة ، وقد استخدمت علي نطاق واسع لنماذج الجوانب من الجهاز العصبي المركزي يعمل في المختبر. علي الرغم من إمكانات شريحة الثقافات في علوم الأعصاب ، والدراسات التي تستخدم الانسجه العصبية الكبار لاعداد مثل هذه الثقافات لا تزال نادره ، وخاصه تلك التي من البشر. استخدام الانسجه البشرية الكبار لاعداد شريحة الثقافات جذابة بشكل خاص لتعزيز فهم الامراض العصبية البشرية ، كما انها تحمل خصائص فريدة من نوعها من الدماغ البشري الناضجة التي تفتقر إلى الشرائح المنتجة من القوارض (عاده حديثي الولادة) النسيج العصبي. يصف هذا البروتوكول كيفيه استخدام انسجه المخ التي تم جمعها من المتبرعين الاحياء الذين قدموا إلى جراحه المخ المعدية لاعداد الثقافات القصيرة الأجل والعائمة الحرة. وتقدم أيضا إجراءات لصيانة واجراء اختبارات البيولوجيا الحيوية والخلايا البيولوجية باستخدام هذه الثقافات. تظهر النتائج التمثيلية ان التصفيح القشري البشري النموذجي يتم الاحتفاظ به في شرائح بعد 4 أيام في المختبر (DIV4) ، مع وجود متوقع لأنواع الخلايا العصبية الرئيسية. وعلاوة علي ذلك ، الشرائح في DIV4 الخضوع للموت خليه قويه عند الطعن مع التحفيز السامة (H2O2) ، مما يدل علي امكانيه هذا النموذج لتكون بمثابه منصة في اختبارات موت الخلايا. هذا الأسلوب ، وهو بديل ابسط وفعاله من حيث التكلفة للبروتوكول المستخدمة علي نطاق واسع باستخدام ادراج غشاء ، ويوصي بشكل رئيسي لتشغيل المقايسات علي المدى القصير تهدف إلى كشف أليات الضمور العصبي وراء امراض الدماغ المرتبطة بالسن. وأخيرا ، علي الرغم من ان البروتوكول مكرس لاستخدام الانسجه القشرية التي تم جمعها من المرضي الذين قدموا إلى العلاج الجراحي لصرع الفص الصدغي المقاوم للادويه ، الا انه يقال ان الانسجه التي يتم جمعها من مناطق/ظروف الدماغ الأخرى يجب ان تكون أيضا تعتبر مصادر لإنتاج الثقافات شريحة العائمة الحرة مماثله.
استخدام عينات الإنسان في البحوث هو بشكل لا لبس فيه خيارا كبيرا لدراسة امراض المخ البشرية ، والتقنيات الحديثة فتحت طرقا جديده لتجريب قويه واخلاقيه باستخدام الانسجه المستمدة من المريض. وقد استخدمت أساليب مثل الثقافات العضوية/شريحة أعدت من الدماغ البشري الكبار بشكل متزايد في نماذج مثل optogenetics1، الكهربية2،3،4،5، اللدونة 6،7،8،9، السمية العصبية/نيوروبروتكايشن10،11،12،13، العلاج الخلوي14، فحص المخدرات15،16،17، علم الوراثة وتحرير الجينات12،18،19،20، من بين أمور أخرى ، كاستراتيجية لتحسين فهم الامراض العصبية خلال مرحله البلوغ.
يعتمد فهم أليات الكامنة وراء امراض المخ البشرية علي الاستراتيجيات التجريبية التي تتطلب عددا كبيرا من المواضيع. وعلي النقيض من ذلك ، في حاله الثقافات الشريحة ، علي الرغم من ان الوصول إلى عينات الإنسان لا يزال صعبا ، فان امكانيه توليد ما يصل إلى 50 شرائح من عينه قشريه واحده تلتف جزئيا علي شرط تجنيد متطوعين متعددين عن طريق زيادة عدد من النسخ المتماثلة وأداء المقايسات لكل الانسجه التي تم جمعها21.
وقد وصفت العديد من البروتوكولات للثقافات الدماغ العضوية/شريحة الثقافات ، بدءا من الكلاسيكية كوة المسودات22،23 إلى الاسطوانه أنبوب24،25،26، شبه نفاذيه الاغشيه واجهه27،28،29،30، والحرة العائمة شرائح31،32. اعتمادا علي خصوصيات التصميم التجريبي ، كل تقنيه لها مزاياها الخاصة وعيوبها. قصيرة الأجل, العائمة الحرة شرائح الثقافات من العقول البشرية الكبار في بعض الحالات مفيده علي الطريقة التي يستخدمها Stoppini et al.27, إذا النظر في حقيقة انه علي الرغم من بقاء الخلية علي المدى الطويل في المختبر عاده ما يكون مصدر قلق كبير عند تقييم ثقافة أسلوب, في كثير تجارب فقط [شورت فتر] من وقت في ثقافة لازمه12,31,32,33,34,35. وفي ظل هذه الظروف ، فان استخدام الثقافات العائمة الحرة يقدم ميزه كونها ابسط وأكثر فعاليه من حيث التكلفة ، فضلا عن انها تشبه بشكل أدق حاله الانسجه البشرية الاصليه من الشرائح المحتفظ بها في الثقافة علي مدي 2-3 أسبوعا.
علي الرغم من إمكانات شريحة الثقافات لعلوم الأعصاب ، والدراسات التي تستخدم الانسجه العصبية الكبار لاعداد مثل هذه الثقافات لا تزال نادره ، وخاصه من البشر. توضح هذه المقالة بروتوكول لاستخدام انسجه المخ التي تم جمعها من المتبرعين البشريين الاحياء المقدمة لجراحه الدماغ المعدية لاعداد الثقافات شريحة العائمة الحرة. وترد تفاصيل إجراءات الحفاظ علي اختبارات البيولوجيا الحيوية والخلوية وأداءها باستخدام هذه الثقافات. وقد ثبت هذا البروتوكول قيمه لتحليل القدرة علي البقاء ووظيفة الخلايا العصبية في التحقيقات علي أليات الامراض العصبية المرتبطة بمرحله البلوغ.
هذا البروتوكول لإنتاج العائمة الحرة ، والثقافات شريحة قصيرة الأجل هو وسيله بديله لزراعه شرائح الإنسان البالغين الاستعمار الكبير. مثل هذا البروتوكول لشرائح الثقافات قد تكون قابله للدراسة علي (ولكن ليس علي سبيل الحصر) optogenetics1,44,45, الكهربائ…
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل من قبل FAPESP (منحه 25681-3/2017 إلى AS), الرؤوس (زمالة ما بعد الدكتوراه PNPD/INCT-A.F. وزمالة ما قبل الدكتوراه إلى N.D.M.) و FAEPA. G.M.A. حاصل علي زمالة الماجستير من FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. يحمل زمالة أبحاث CNPq. نشكر المرضي وعائلاتهم علي التبرع بالانسجه المقطوعة لهذه الدراسة. ونود ان نعترف بدعم المقيمين والممرضين والفنيين وفريق CIREP ، من المستشفى السريري في كليه الطب في ريبيراو بريتو ، جامعه ساو باولو ، الذي ساعد في مختلف مراحل العملية.
2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution | Sigma Aldrich | A3449 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 500-0205 | |
EDTA | Sigma | T3924 | Used in RIPA buffer |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
NaCl | Merck | 1064041000 | Used in RIPA buffer |
Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
Non-fat dry milk (Molico) | Nestlé | Used for membrane blocking | |
PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
Penicilin/Streptomicin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Potassium Chloride | Merck | 1049361000 | |
Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
SDS | Sigma | L5750 | Used in RIPA buffer |
TEMED | GE | 17-1312-01 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
Tris | Sigma | T-1378 | Used in RIPA buffer |
Triton x-100 | Sigma | X100 | Used in RIPA buffer |
Ultrapure Water | Millipore | Sterile water, derived from MiliQ water purification system | |
Equipment and Material | |||
24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) | GE | 29047575 | |
Carbogen Mixture | White Martins | 95% O2, 5% CO2 | |
CO2 incubator | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation of slices 5% CO2, 36ºC |
Microplate Reader | Molecular Devices | ||
Microtubes | Greiner | 001608 | 1,5mL microtube |
Motorized pestle | Kimble Chase | ||
Plastic spoon | Size of a dessert spoon | ||
Razor Blade | Bic | Chrome Platinum, used in slicing with vibratome | |
Scalpel Blade | Becton Dickinson (BD) | Number 24 | Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller |
Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer | |
Vibratome | Leica | 14047235612 – VT1000S | |
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry | |||
Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 – ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) | Vector | BA-9200 | |
DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
Entellan | Merck | 107960 | |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
Gelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Used for coating slides |
Microtome | Leica | SM2010R | Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
Xylene | Synth | 01X1001.01.BJ |