Формирование сферонтальных связок человека сфероиды на chitosan Фильмы
Summary
Здесь мы представляем протоколы культивирования человеческих пародонтальных связок (PDL) клеточных сфероипов по пленкам хитозана. Культура трехмерных (3D) клеточных сфероидов является альтернативой обычной системе культуры тканей (TCPS).
Abstract
Клетки пародонтальной связки (PDL) имеют большие перспективы для регенерации тканей пародонта. Условно, клетки PDL культивируются на двухмерных (2D) субстратах, таких как полистирол культуры тканей (TCPS). Тем не менее, характерные изменения клеток PDL наблюдались во время культуры in vitro. Это явление, вероятно, потому, что 2D TCPS отличается от in vivo трехмерной (3D) микросреды. По сравнению с клетками, культивируемыми на 2D субстратах, клетки, выращенные в 3D микроокружении, обладают большим сходством с клетками in vivo. Таким образом, модели культуры 3D-клеток являются перспективной альтернативой традиционной 2D монослойной клеточной культуре. Для улучшения традиционных моделей культуры клеток PDL мы недавно разработали метод 3D-культуры клеток, который основан на сфероидном образовании клеток PDL на пленках хитозана. Здесь мы представляем подробные протоколы клеточной сфероидной культуры, основанные на фильмах хитозана. 3D-система культуры PDL клеточных сфероидов преодолеть некоторые ограничения, связанные с обычной 2D монослойной клеточной культуры, и, таким образом, может быть пригодным для производства PDL клеток с повышенной терапевтической эффективностью для будущего регенерации ткани пародонта.
Introduction
Пародонтит, инициализированный главным образом зубной налет1, характеризуется повреждением пародонтальных тканей, включая пародонтальные связки (PDL), альвеолярной кости и цемента. Текущие методы лечения пародонтита, как правило, успешно предотвращают прогресс активного заболевания, но регенерация потерянных тканей пародонта остается клинической проблемой. В последнее время был достигнут значительный прогресс в клеточных подходах к регенерациитканей пародонта, чтобы преодолеть недостатки текущих методов лечения 2,3,4.
Наш предыдущий систематический обзор показал, что PDL клетки показали большой потенциал для регенерации пародонта5. Условно, клетки PDL культивируются на двухмерных (2D) субстратах, таких как полистирол культуры тканей (TCPS). Однако характерные изменения клеток PDL наблюдались во время культуры in vitro6. Это явление, вероятно, потому, что 2D TCPS отличается от in vivo трехмерной (3D) микросреды7. По сравнению с клетками, культивируемыми на 2D субстратах, клетки, выращенные в 3D микроокружении, обладают большим сходством с клетками in vivo8. Таким образом, модели культуры 3D-клеток являются перспективной альтернативой традиционной 2D монослойной клеточной культуре.
Обычный метод 3D-культуры инкапсулирует клетки в 3D биоматериалах. По сравнению с клетками, инкапсулированными в 3D биоматериалах, клеточные сфероиды более тесно имитируют ситуацию in vivo, потому что сфероиды являются агрегатами клеток, растущих свободными от посторонних материалов9,10,11, 12. Сообщается, что клеточные сфероиды способствовали биоактивности MSC путем сохранения внеклеточных матричных (ECM) компонентов, включая фибронектин и ламинин13. Для улучшения обычных моделей культуры клеток PDL, мы недавно разработали метод культуры 3D PDL, который основан на сфероидном образовании клеток PDL на пленках хитозана14. Сфероидное образование увеличило способность самообновления и остеогенной дифференциации клеток PDL14. Здесь мы представляем подробные протоколы pdL клеточной сфероидной культуры, основанные на фильмах хитозана. 3D-система культуры PDL клеточных сфероидов преодолеть некоторые недостатки, связанные с обычной культурой клеток TCPS, и, таким образом, может быть пригодным для производства клеток PDL с повышенной терапевтической эффективностью для будущего регенерации тканей пародонта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящее исследование ввело систему 3D-культуры клеток для преодоления некоторых ограничений, связанных с обычной 2D монослойной клеточной культурой. Согласно протоколу, клеточные сфероиды PDL успешно формировались культивированием клеток на хитозановых пленках. Наше предыдущее иссл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было организовано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC 81700978), Фундаментальными исследовательскими фондами для центральных университетов (1504219050), Фондом естественных наук Шанхая (17’14432800) и Шанхайским проектом медицинских исследований ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. 암 연구학. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
