Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

Summary

Presentiamo un metodo per isolare e coltivare cellule epiteliali derivate dalla ghiandola umana primaria. Queste cellule presentano modelli di espressione genica coerenti con loro di origine epiteliale salivari e possono essere coltivate come salisfere su matrici di membrana seminterrato derivate da cellule tumorali Engelbreth-Holm-Swarm o come monostrati su piatti di coltura trattati.

Abstract

Le ghiandole salivari sono un sito di notevole interesse per i ricercatori interessati a molteplici aspetti della malattia umana. Uno degli obiettivi dei ricercatori è quello di ripristinare la funzione delle ghiandole danneggiate dalle terapie radiologiche o a causa di patologie associate alla sindrome di Sjàgren. Un secondo obiettivo dei ricercatori è quello di definire i meccanismi con cui i virus si replicano all’interno del tessuto ghiandolare dove possono quindi ottenere l’accesso a fluidi salivari importanti per la trasmissione orizzontale. Questi obiettivi evidenziano la necessità di un modello di ghiandola salivare in vitro robusto e accessibile che possa essere utilizzato dai ricercatori interessati alle suddette aree di ricerca. Qui discutiamo di un semplice protocollo per isolare le cellule epiteliali dalle ghiandole salivari umane e propagarle in vitro. Il nostro protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per soddisfare le esigenze dei singoli studi. In breve, il tessuto salivare è separati meccanicamente ed enzimaticamente per isolare singole cellule o piccoli ammassi di cellule. La selezione per le cellule epiteliali avviene placcando su una matrice di membrana seminterrato in presenza di media ottimizzati per promuovere la crescita delle cellule epiteliali. Queste colture risultanti possono essere mantenute come cluster tridimensionali, definite “salispheres”, o coltivate come un monostrato su piatti di coltura dei tessuti plastici trattati. Questo protocollo si traduce nella crescita di una popolazione eterogenea di cellule principalmente epiteliali che possono essere propagate per 5-8 passaggi (15-20 raddoppi della popolazione) prima di sottoporsi alla senescenza cellulare.

Introduction

Nei mammiferi le ghiandole salivari sono organizzate in 3 coppie di principali ghiandole salivari: le ghiandole parotide, submandibolali e sublinguali. Esiste anche una serie di ghiandole minori situate sulla lingua e sparse in tutta la cavità orale¹. Le principali ghiandole sono responsabili del volume sfuso di saliva prodotta². Oltre a fornire protezione antimicrobica attraverso fattori secreti, la saliva è importante nel processo di masticazione e lubrificazione del cibo mentre passa attraverso l’esofago². Come tale, disfunzione ghiandola salivare rappresenta un problema medico in cui i malati che non sono in grado di produrre abbastanza saliva sono più inclini a malattie in via di sviluppo come cavità dentali o candidiasi orale³. Inoltre, la riduzione della saliva comporta una maggiore difficoltà a mangiare e digerire il cibo avendo un impatto significativo sulla qualità della vita.

La disfunzione della ghiandola salivare si riscontra principalmente in pazienti affetti dalla sindrome di Sjagren, un disturbo autoimmune, o in pazienti con cancro alla testa e al collo che hanno subito una terapia di irradiola^{3,4,5 6}. Gli acini di segreteria danneggiati all’interno delle ghiandole a seguito dell’autoimmunità o della radioterapia non subiscono l’auto-rinnovamento, il che si traduce in un paziente che vive con danni irreversibili⁶. Lo studio delle ghiandole salivari ha anche raccolto l’attenzione o i ricercatori interessati ai meccanismi della patogenesi virale. Alcuni patogeni, come il citomegalovirus umano (HCMV), si replicano persistentemente all’interno delle ghiandole salivari, che poi consente la trasmissione del virus nascente a un nuovo ospite tramite saliva^7,8. Pertanto, vi è una necessità insoddisfatta di sviluppare modelli robusti e riproducibili in vitro di tessuto ghiandola salivare per affrontare e comprendere una vasta gamma di problemi medici.

Diversi modelli del sistema di ghiandola salivare murine sono stati utilizzati come punto di partenza per comprendere e caratterizzare le diverse cellule epiteliali che formano le ghiandole salivari^9,10. Esistono differenze ovvie e principali tra le ghiandole salivari umane e murine¹¹. In particolare la ghiandola parotide umana è più grande rispetto alla ghiandola submandibolare, mentre il topo submandibolare e parotide sono molto simili nella dimensione^1,2,11. Sebbene esistano linee di cellule submandibolali umane immortalate, ci sono grandi preoccupazioni che le cellule immortalate non mantengano accuratamente il fenotipo del tessuto primario e le preoccupazioni secondarie che le cellule immortalate non sono effettivamente derivate da salivare epitelio stesso¹². Per questi motivi c’è un interesse e la necessità di studiare il tessuto salivare primario dall’uomo.

Qui descriviamo un protocollo per isolare le cellule epiteliali primarie dalle ghiandole salivari umane per la coltura dei tessuti. Il nostro protocollo si basa sulle opere di Pringle et al. e Tran et al. con modifiche apportate per semplificare generalmente le loro procedure^13,14. In primo luogo, mentre il protocollo di Tran et al.richiede una lunga incubazione di cinque ore per digerire ezigmaticamente il tessuto salivare, il nostro protocollo modificato ha avuto successo con un minimo di incubazione di un’ora, simile a quella di Pringle et al. In secondo luogo, usiamo diversi enzimi per la digestione tissutale, in particolare non usiamo la trypsin come viene utilizzato nel protocollo originale di Tran et al., ma usiamo invece una miscela di dispasi e collagenase. Preferiamo evitare la trypsinnelle nei passaggi di digestione iniziali come un recente studio ha suggerito che la digestione iniziale del tessuto salivare da trypsin risultati in ridotta vitalità cellulare, forse dalla perdita di una popolazione di cellule staminali rare¹⁵. Infine, procupiamo le salisfere sulla superficie della matrice della membrana seminterrato (BMM) utilizzando un supporto disponibile in commercio originariamente formulato per la propagazione delle cellule epiteliali bronchiali. Il nostro protocollo può essere utilizzato per isolare le cellule salivari dalle ghiandole parotide, submandibolare e sublinguali. Queste cellule esprimono amilasi salivare e altri geni salivari specifici che indicano che mantengono unfenotipo simile a quello delle cellule epiteliali acinari 7 . Abbiamo generato con successo colture salivari da >50 campioni primari di tessuto umano utilizzando questa metodologia. Inoltre, le cellule salivari primarie possono essere facilmente crioconservate per l’uso in un secondo momento.

Protocol

Questi protocolli e studi sono stati esaminati e approvati dall’Institutional Review Board dell’Università di Cincinnati (federal-wide Assurance #00003152, protocollo IRB 2016-4183). Il tessuto salivare è comunemente resected in molte procedure chirurgiche della testa e del collo e di solito non è coinvolto dal processo maligno. Tipicamente, il tessuto della ghiandola salivava appena resected viene utilizzato entro 2-4 h dopo la rimozione dal paziente (Figura 1A). <p class="jove_title…

Representative Results

Due-tre giorni dopo la placcatura delle cellule dal tessuto digerito su BMM, le cellule formeranno facilmente piccoli cluster che continueranno ad espandersi fino a 15-20 cellule per cluster (Figura 2A). I detriti cellulari e le cellule morte staccate sono tipicamente visti e dovrebbero essere rimossi aspirando e reintegrandosi con supporti freschi. Le cellule continueranno a proliferare come salifere per circa 3-10 giorni, o finché lo strato BMM rimane inta…

Discussion

La disfunzione salivare rappresenta una preoccupazione per la qualità della vita per coloro che soffrono di sindrome di Sjagren e per coloro che sono sottoposti a radioterapia per tumori adiacenti alle ghiandole salivari^{3,4,5, 16}. Una terapia proposta per il trattamento di questi pazienti è quella di far crescere cellule staminali salivari funzionali o organoidi in vitro, che possono quindi …

Materials

100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI