在这里,我们提出一个协议,使用β-est AID系统,有效和具体地耗尽酵母糖精中感兴趣的蛋白质。
植物辅助素结合受体 TIR1 可识别含有特定辅助诱导脱粒 (AID) 在辅助素存在时的蛋白质,针对它们进行降解。该系统在许多非植物真核生物中被利用,因此,一种带有AID图案的目标蛋白在添加辅助物后降解。TIR1表达式的级别至关重要;即使缺乏辅助蛋白,过度的表达也会导致AID标记的蛋白质降解,而低表达会导致缓慢耗竭。建立了β-雌二醇诱导AID系统,在β-雌二醇诱导启动子的控制下表达TIR1。在添加辅助剂之前,通过改变使用β-雌二醇的孵育时间,TIR1的含量是可调的。该协议描述了如何使用AID系统快速耗尽目标蛋白质。适当的β-雌二醇孵育时间取决于靶蛋白的丰度。因此,有效耗竭取决于最佳时序,这也最大限度地减少了与辅助剂无关的损耗。
条件突变,如温度敏感突变体,是研究基本蛋白质的有力工具,允许在允许条件下细胞生长,但在不容许的条件下导致功能丧失。然而,细胞代谢可能严重干扰生长条件的变化,需要诱导缺陷,也可能产生偏离目标的影响。已经开发出几种方法,其中感兴趣的蛋白质有条件地隔离1,或者通过添加小分子控制其表达2,3。该协议使用辅助蛋白和辅助诱导脱粒 (AID) 系统来有效耗尽目标蛋白质。
AID系统起源于植物,其中一种辅助蛋白(在本议定书中使用indole-3-醋酸(IAA),刺激Aux/IAA蛋白与TIR1的相互作用,TIR1是SCF U3泛性联苯复合物4的成员。SCF复杂相互作用导致Aux/IAA家族蛋白多聚体化,导致其降解为蛋白酶体5,6。
该系统以前被改造用于酵母糖精7,8通过表达来自酵母细胞的 Oriza sativa (osTIR) 的 TIR1 蛋白质, 在那里它能够与内源酵母相互作用SCF 复合体。感兴趣的蛋白质被标记从Aux/IAA蛋白IAA17的图案,以瞄准它的降解。IAA17 的功能截断后来被开发,如 AID®8、9、10,包含来自阿拉伯拟南芥IAA17的 43 个氨基酸辅助素敏感主题,以及一个表位标记,以启用检测。
该系统最初适应在萌芽酵母7,8表达的osTIR1蛋白质从酵母GAL启动子。表达需要转向生长介质,以角质素作为唯一的碳源,不幸的是,这导致了二次转移,细胞代谢发生了广泛的变化11。另一方面,据报道,TIR1的构成表达在缺乏辅助蛋白/IAA12的情况下,如果表达水平高,则可能导致目标蛋白降解,而低TIR1表达会导致低效耗竭。开发了一种名为β-est AID的改进AID系统,其中osTIR受一个可调节的诱导启动子控制,该启动子可调谐到靶蛋白,对细胞代谢的影响最小。为此,构建了一个人工转录因子(ATF),其中VP16病毒转录活化剂与雌激素受体和四个Zn手指DNA结合域(DBD)融合。当β-雌二醇(雌激素)存在时,ATF可以进入细胞核,并通过与启动子(Z4EVpr)13、12结合来诱导osTIR转录。
在加入β-雌二醇12后,osTIR表达通常可检测到约20分钟。然而,osTIR表达的最佳持续时间,以实现有效消耗带辅助蛋白的标记蛋白,同时在添加辅助蛋白之前避免耗竭,需要为每个目标蛋白进行经验测定。这种预孵育的大致时间可以从糖霉菌基因组数据库中的丰度值(SGD https://www.yeastgenome.org/)中估计。如图1所示,丰富的蛋白质Dcp1(2880至4189分子/细胞)需要40分钟的β-雌二醇预孵育,没有观察到与辅助素无关的消耗。较不丰富的蛋白质Prp2(172至211分子/细胞)在预孵育后仅20分钟就严重耗尽。建议在此初始估计时间之前或之后测试两个额外的预孵育时间(20 分钟是建议的最短时间)。最佳预孵育时间是靶蛋白在添加辅助蛋白之前没有耗尽的时间,一旦添加辅助蛋白,消耗是可以接受的,或者蛋白质水平接近可能达到的最低水平。因此,从图1b,对于预孵化30分钟的Prp22,在添加辅助后10分钟的水平没有下降多少。与40分钟的预孵育和15分钟的IAA相比,在几乎没有额外消耗的情况下,用超过10分钟的辅助剂孵育或超过30分钟的预孵育没有好处,特别是因为有证据表明非辅助性依赖在40分钟内耗尽。对于预孵育40分钟的Dcp1(在添加辅助剂之前蛋白质水平约为100%的最后一点),使用辅助蛋白消耗15至20分钟是可以接受的。建议尽量缩短耗竭时间,以减少对细胞代谢的二次影响14。
本文演示如何使用β-est AID系统,通过优化osTIR表达β-雌醇孵育的时间,在添加辅助蛋白之前,在IAA添加时实现快速目标蛋白质消耗而不消耗。
优化良好的方案可以产生目标蛋白的快速和高效消耗。确定使用β-雌二醇的近似预孵育时间很重要,因为这增加了耗竭的可重复性,但可以容忍预孵育时间的微小变化。另一方面,由于蛋白质水平下降非常迅速,在添加辅助剂后必须注意时间。
这种方法的一个优点是,通过不同的预孵育时间与β-雌二醇和IAA孵育时间的组合,可以实现调谐的消耗。例如,如果需要,通过减少预孵育时间,目标蛋白可以更缓慢地耗尽。
与 OsTIR 构成的系统系统相反,β-est AID 系统具有某些优势。例如,如果靶蛋白对生存至关重要,则 osTIR 的调节表达可以避免目标蛋白过早耗尽。此外,osTIR的表达可以调整,以适应目标蛋白的丰度和降解的易感性,并且消耗可以是快的,也可以是缓慢的。与拉帕霉素不同,两种小分子效应器β-雌二醇和辅助素,在这里使用的条件下不会干扰酵母代谢,不像在锚离系统1中使用的雷帕霉素。
应该注意的是,标记一些蛋白质会破坏它们的功能,这是任何目标耗尽系统的问题。在这种情况下,当 C 端标记不起作用时,N 终端标记可能工作。此外,并非所有蛋白质都会被有效耗尽;例如,目标蛋白上的 AID 标记可能无法访问 osTIR 蛋白。因此,在AID标记后,在优化β-雌二醇预孵化和辅助素处理的时间之前,应测试每个靶蛋白对生长标记的任何影响,并确定消耗是否有效。
此 AID® 系统非常简单,可与任何不涉及进一步生长的后续实验程序兼容,例如蛋白质、DNA 或 RNA 分析或显微镜。此外,该系统与硫标签结合,以纯化新生的RNA20时效果良好。
该系统提供了一种快速、具体和可重复的方法,在不影响酵母细胞代谢的情况下消耗蛋白质。
The authors have nothing to disclose.
感谢简·里德发起这一计划,芭芭拉·特劳为发展,瓦希德阿斯兰扎德为”乌拉循环”建设和苏珊娜德卢卡斯为许多有益的讨论。这项工作得到了墨西哥国家科学委员会(CONACYT)和爱丁堡大学生物科学学院的奖学金,以及威康大学获得IEM博士学位[105256]的资助,以及威康资助[104648]给JD Beggs.韦康细胞生物学中心的工作得到了威尔康核心基金的支持[092076]。
Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
Agar | Formedium | AGA03 | |
Β-estradiol | Sigma Aldrich | E2758-1G | 10mM solution in ethanol. Store at -20 oC |
DMSO | Alfa Aesar | 42780 | DMSO should be solid at 4 oC |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
IAA 1H-Indole-3-acetic acid | Across Orgainics | 122150100 | Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 oC. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530 | |
Peptone | Formedium | PEP03 | |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Yeast Extract | Formedium | YEA03 | |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 |