Summary
Utilizamos eletrodos de gravação e estimulação em fatias de cérebro hipocampal longitudinal e eletrodos de gravação e estimulação longitudinalmente posicionados no hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciais pós-sinápticos extracelulares e demonstrar plasticidade sináptica de longo prazo ao longo do CA1 interlamelar longitudinal.
Abstract
O estudo da plasticidade sináptica no hipocampo concentrou-se no uso da rede lamelar de i-CA1. Menos atenção foi dada à rede interlamelar longitudinal CA1-CA1. Recentemente entretanto, uma conexão associacional entre os neurônios piramidal CA1-CA1 foi mostrada. Portanto, há a necessidade de investigar se a rede de CA1-CA1 interlamelar longitudinal do hipocampo suporta a plasticidade sináptica.
Nós projetamos um protocolo para investigar a presença ou a ausência de plasticidade sináptica a longo prazo na rede de CA1 hippocampal interlamelar usando gravações eletrofisiológicas do campo ambos in vivo e in vitro. Para as gravações de campo extracelular in vivo, os eletrodos de gravação e estimulação foram colocados em um eixo septal-temporal do hipocampo dorsal em um ângulo longitudinal, para evocar potenciais pós-sinápticos excitatórios. Para as gravações in vitro do campo extracelular, as fatias longitudinais hippocampal foram cortadas paralelas ao plano septal-temporal. Os eletrodos de gravação e estimulação foram colocados no estrato Oriens (S. O) e no estrato radiatum (S. R) do hipocampo ao longo do eixo longitudinal. Isto permitiu-nos investigar a especificidade direcional e da camada de potenciais pós-sináptica excitatórios evocados. Protocolos já estabelecidos foram utilizados para induzir potenciação a longo prazo (LTP) e depressão a longo prazo (LTD) tanto in vivo como in vitro. Nossos resultados demonstraram que a rede de CA1 interlamelar longitudinal suporta a potenciação de longo prazo dependente do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) (LTP) sem especificidade direcional ou de camada. A rede interlamelar, entretanto, em contraste com a rede lamelar transversal, não apresentou com nenhuma depressão a longo prazo significativa (LTD).
Introduction
O hipocampo tem sido amplamente utilizado em estudos cognitivos1,2,3. A rede lamelar do hipocampal na linha central transversal dá forma ao circuito Tri-Synaptic que é compo do giro dentate, do, do i, e das regiões CA1. A rede lamelar é considerada uma unidade paralela e independente4,5. Este ponto de vista lamelar influenciou o uso de orientação transversal e de fatias transversais para Estudos eletrofisiológicos in vivo e in vitro do hipocampo. À luz da pesquisa emergente, a hipótese lamelar está sendo reavaliada6 e a atenção também está sendo dada à rede interlamelar do hipocampo. No que diz respeito à rede interlamelar hipocampal, a região do "o" foi investigada há muitotempo7,8,9,10, porém a região do hipocampal longitudinal CA1 recebeu relativamente pouca atenção até recentemente. Com relação à rede interlamelar CA1, as propriedades sinápticas de curto prazo ao longo do eixo de CA1 hipocampal longitudinal dorsoventral de ratos foram mostradas para variar11. Além disso, aglomerados de células hipocampais respondendo à fase e ao local foram encontrados para serem organizados sistematicamente ao longo do eixo longitudinal do hipocampo em ratos, passando por uma tarefa de memória de curto prazo12. Também, as atividades epilépticas da apreensão foram encontradas para ser sincronizadas ao longo do hipocampo inteiro ao longo do eixo longitudinal13.
A maioria dos estudos da região do hipocampal de CA1 longitudinal no entanto, têm utilizado a entrada das regiões de "o" de CA1 para as áreas11,14,15. Usando um protocolo único para fazer cortes longitudinais do cérebro, nosso trabalho precedente demonstrou a conectividade associacional de neurônios piramidal CA1 ao longo do eixo longitudinal e implicou sua habilidade de processar eficazmente a sinalização neuronal16. Entretanto, há uma necessidade de determinar se os neurônios piramidal CA1 ao longo da linha central longitudinal sem entrada transversal podem suportar a plasticidade sináptica a longo prazo. Este achado pode adicionar outro ângulo em investigações de problemas neurológicos pertencentes ao hipocampo.
A capacidade dos neurônios para adaptar a eficácia da transferência de informação é conhecida como plasticidade sináptica. A plasticidade sináptica é implicada como o mecanismo subjacente para processos cognitivos como aprendizado e memória17,18,19,20. A plasticidade sináptica a longo prazo é demonstrada como a potenciação a longo prazo (LTP), que representa o fortalecimento da resposta neuronal, ou a depressão a longo prazo (Ltd), que representa o enfraquecimento da resposta neuronal. A plasticidade sináptica de longo prazo tem sido estudada no eixo transversal do hipocampo. Entretanto, este é o primeiro estudo para demonstrar a plasticidade sináptica a longo prazo no eixo longitudinal hippocampal de CA1 neurônios piramidal.
Construindo a partir de um protocolo usado por Yang et al.16, projetamos o protocolo para demonstrar LTP e Ltd no eixo longitudinal hipocampal dos neurônios piramidais CA1. Foram utilizados camundongos machos C57BL6 com idades variando entre 5-9 semanas de idade para experimentos in vitro e 6-12 semanas de idade para experimentos in vivo. Este artigo detalhado mostra como as fatias longitudinais do cérebro do hippocampal dos ratos foram obtidas para gravações in vitro e como gravações in vivo foram gravadas no eixo longitudinal. Para as gravações in vitro, investigamos a especificidade direcional da plasticidade sináptica de CA1 longitudinal, visando a extremidade septal e temporal do hipocampo. Nós igualmente investigamos a especificidade da camada da plasticidade sináptica CA1 longitudinal gravando dos Oriens do estrato e do radiatum do estrato do hipocampo. Para gravações in vivo, investigamos os ângulos que melhor correspondem à direção longitudinal do hipocampo.
Usando ambas as gravações in vivo e in vitro do campo extracelular, nós observamos que os neurônios piramidal longitudinalmente conectados de CA1 apresentados com LTP, não Ltd. A orientação transversal envolvendo ambos os neurônios de i. e CA1, no entanto, suporta ambos LTP e LTD. A distinção nas capacidades sinápticas entre a orientação transversal e longitudinal do hipocampo poderia significar especulativamente diferenças em sua conectividade funcional. Mais experimentos são necessários para decifrar as diferenças em suas capacidades sinápticas.
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Protocol
Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes e regulamentos do cuidado animal e uso do laboratório do Instituto Nacional de saúde. Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade da cidade de Hong Kong e da Universidade Nacional de Incheon.
1. gravação de campo in vivo
- Preparação animal
- Injetar uretano (0, 6 g por 25 g de peso) via intraperitoneal para anestesiizar o rato. Suplemento com injeção intramuscular de atropina (0, 5 mg/kg). Mantenha o mouse em um ponto escuro e silencioso até que a anestesia completa entra em vigor.
Cuidado: o urethane tem o potencial carcinogénico. Manuseie-o com cuidado e use roupas protetoras para evitar o contato com a pele exposta.
Nota: Alternativamente, o isoflurano pode ser usado como anestesia. - Verifique a profundidade da anestesia intermitentemente até que um plano cirúrgico completo da anestesia entra em vigor. Verifique se há profundidade de anestesia realizando pinch toe, pitada de orelha, cauda pitada e testes de toque corneano para observar a resposta do mouse para estímulos físicos.
Nota: um reflexo ou movimento voluntário não deve ser observado quando o mouse está em um plano cirúrgico completo de anestesia. - Para o teste da pitada do dedo do pé, estenda o Hind ou o foreleg do rato e aperte firmemente com um par de fórceps ou de dedos sem corte. O rato não é confirmado para a anestesia completa se retira a perna ou agita o corpo, tem uma taxa respiratória aumentada observável ou faz sons vocais.
- Para o teste da pitada da orelha, aperte as extremidades do Pinna com um par de fórceps sem corte ou os dedos firmemente. A anestesia completa não é confirmada se o mouse move os bigodes para a frente, balança a cabeça, faz sons vocais ou tem uma taxa respiratória aumentada observável.
- Para o teste de pitada de cauda, segure a cauda do mouse suavemente e aperte firmemente com um forcep sem corte ou dedo. Nenhum movimento de cauda, som vocal ou aumento observado na frequência respiratória deve ser observado quando totalmente anestesiado para procedimentos cirúrgicos.
- Para o teste de toque corneano, toque a córnea do mouse suavemente, com um pavio de algodão. Nenhum movimento da pálpebra, movimento do Whisker ou aumento observável na taxa respiratória deve ser observado quando anestesiado inteiramente para a cirurgia.
- Raspar o cabelo no pescoço e crânio do mouse.
- Coloque o mouse totalmente anestesiado em uma almofada de aquecimento definida como 37 ° c e insira a sonda de temperatura retal no reto. Isso permite que o calor produzido pela almofada de aquecimento para ajustar em resposta a mudanças de temperatura do corpo do mouse.
- Aplique gel ocular para umedecer os olhos do rato.
- Puxe a língua para fora para o lado dos lábios suavemente usando fórceps e fixar os dois dentes da frente no segundo ou terceiro furo dos dentes do instrumento estereotáxica. Fixar o crânio do mouse firmemente usando o olho-braçadeira.
Nota: Alternativamente, pode ser utilizada uma pinça de orelha estereotáxica. - Observando um microscópio, separe o tecido subcutâneo e os músculos no final do osso interparietal e occipital do rato com um bisturi para expor a cisterna magna. Blot a dura-máter seca com um cotonete.
- Perfure suavemente a cisterna magna fazendo um corte raso com uma lâmina afiada de bisturi pontiagudo para drenar o líquido cefalorraquidiano (CSF). Prenda um cotonete de algodão para manter a drenagem do CSF.
- Injetar uretano (0, 6 g por 25 g de peso) via intraperitoneal para anestesiizar o rato. Suplemento com injeção intramuscular de atropina (0, 5 mg/kg). Mantenha o mouse em um ponto escuro e silencioso até que a anestesia completa entra em vigor.
- Craniotomia
- Segurando a pele no couro cabeludo com fórceps, corte e retire a pele com um par de tesouras cirúrgicas. Corte a pele suficiente para expor as marcas de Bregma e lambda no couro cabeludo. Mantenha a região exposta seca.
- Ajuste o crânio apertado do mouse para permitir que os pontos de Bregma e lambda sejam alinhados em um nível horizontal de altura semelhante. Evite inclinar a cabeça tanto na posição anterior-posterior quanto na posição lateral medial.
- Marque os pontos correspondentes à região hipocampal usando o auxílio de um paquímetro Vernier. Use o cérebro do mouse em um livro de coordenadas estereotáxica como uma referência para ajudar a determinar as coordenadas exatas.
Nota: a localização para marcar para a incisão para o hipocampo são 1 mm x 3 mm na linha média referida como anterior-posterior (AP) usando a Bregma como ponto de referência, e 3 mm x 3 mm perpendicular à linha média (ML) para conectar os pontos na linha média. As coordenadas estereotáticas são administradas como (AP: 1,3 e ML: 3, 3). - Faça uma incisão no crânio acima da região dorsal do hipocampo ao longo dos pontos marcados usando um bisturi ou broca de alta velocidade enquanto observa um microscópio.
Nota: uma abertura em forma retangular com um tamanho de 2 mm x 3 mm deve ser obtida após a incisão. Mantenha a área exposta limpa para evitar ferimentos no cérebro. - Cuidadosamente Retire o crânio solto com fórceps para expor a dura-máter e usar uma seringa ou conta-gotas para aplicar suavemente solução salina fisiológica para manter a superfície úmida.
- Retire a dura-máter com cuidado com a agulha ou pinça ponta afiada.
Nota: tenha cuidado para não causar qualquer dano ao tecido cerebral durante a craniotomia. Isso levará ao inchaço do cérebro e afetará os resultados. - Mantenha o tecido do cérebro exposto úmido aplicando soro fisiológico ou óleo inerte usando um conta-gotas ou seringa.
- Gravação in vivo
- Fixar e posicionar o eletrodo de estimulação e gravação firmemente no suporte estereotáxico. Ajuste o instrumento estereotáxico de acordo com a posição das coordenadas AP e ML correspondentes para os eletrodos de estimulação e gravação acima do hipocampo dorsal do CA1.
Nota: Use o cérebro do rato em coordenadas estereotáxica como um guia na localização das coordenadas para a região do hipocampal de CA1 longitudinal dorsal. Por exemplo, uma coordenada estereotáxica para a região do hipocampal CA1 será (AP 1,5, ML 1,0) para o eletrodo de gravação e (AP 1,7, ML 1,5) para o eletrodo de estimulação. - Localize o eletrodo estimulante lateral ao eletrodo de gravação em uma direção longitudinal.
Nota: Assegure-se de que os eletrodos de estimulação e gravação estejam limpos antes do uso. Isto impede a introdução do ruído ao gravar. - Para gravações, use eletrodos multicanais. Primeiro, localize as coordenadas estereotáticas para a região do hipocampal CA1 usando o primeiro canal. Posicione os eletrodos restantes de forma que o ângulo de estimulação e os eletrodos de gravação estejam na faixa de 30 ° a 60 ° em relação à linha média do ponto de Bregma.
Nota: este ângulo corresponde à orientação longitudinal da região do hipocampal CA1. - Como um controle, localize o eletrodo de gravação acima da região CA1 e o eletrodo de estimulação acima da região de i-o do hipocampo dorsal. Por exemplo, usando o cérebro do mouse em coordenadas estereotáxica como um guia, uma coordenada estereotáxica para a região do hipocampal CA1-de-m será (AP 1,8, ML 1,0) para o eletrodo de gravação e (AP 1,5, ML 1,5) para o eletrodo de estimulação.
Observação: esta etapa é um controle alternativo e deve ser feita em um experimento separado. - Coloque o eletrodo de referência em uma parte distal da região cerebral exposta ou a pele do mouse.
- Ligue o sistema de gravação.
- Abra o software para gravação e aquisição de dados.
Nota: os laboratórios diferentes têm seu software preferido para a gravação e a aquisição de dados. - Observando um microscópio, abaixe os eletrodos de gravação e estimulação lentamente usando o micromanipulador até que ele apenas toca a superfície do cérebro. Marque o ponto como o ponto zero para começar a calcular a profundidade exata para a região hipocampal.
Nota: o micromanipulador pode ser usado para monitorar a profundidade na qual o eletrodo é inserido em um determinado momento. Observe um aumento na impedância apenas quando o eletrodo toca a superfície do cérebro. - Abaixe lentamente os elétrodos à profundidade aproximada que corresponde às coordenadas stereotactic escolhidas para o hipocampo CA1.
Nota: Use o cérebro do rato em coordenadas estereotáticas como um guia para obter a profundidade aproximada correspondente às coordenadas estereotáticas escolhidas. - Dê a estimulação (duração de 100 μs, repetida em intervalos de 30 s) e ajuste a profundidade do elétrodo nas etapas de 50 μm ou menos até que um potencial pós-sináptica excitatórios do campo evocado estável (fepsp) esteja observado.
Nota: um estímulo de 20 μA é geralmente suficiente para evocar uma resposta observável. - Assegure-se de que um fEPSP estável estêve evocado variando a intensidade do estímulo. Um aumento notável na inclinação ou na amplitude do fEPSP deve ser observado com cada intensidade aumentada do estímulo. Isso é denominado como a curva de entrada-saída. Crie uma curva de entrada-saída (I-O) para detectar a intensidade máxima de estímulo na qual não há mais aumento na inclinação do fEPSP evocado (Figura 6).
Nota: Descarte os dados e mude a posição do eletrodo se o vôlei de fibra desaparecer durante o experimento. - Use a curva de entrada-saída para definir a intensidade da linha de base como 40-50% do máximo. Use a intensidade de estímulo correspondente para a gravação de linha de base.
- Registre o potencial de campo local como uma linha de base para 20-30 min.
- Use a mesma curva de entrada-saída para definir a intensidade do estímulo para evocar a estimulação de alta frequência (HFS) ou tétano para 75% da intensidade máxima. Alternativamente, ao induzir depressão a longo prazo, manter a mesma intensidade de estímulo usada para registrar a linha de base ao evocar a estimulação de baixa frequência (LFS).
- Aplique uma estimulação tetânica de 100 Hz pulsos 4 vezes com um intervalo de 10 s para induzir LTP.
Observação: Use este protocolo somente quando estiver trabalhando em um experimento de potenciação de longo prazo. - Aplique estimulação de baixa frequência de 5 Hz (900 estímulos durante 3 min), 1 Hz LFS (900 estímulos durante 15 min), ou 1 Hz emparelhado-pulso (50 ms emparelhado-pulso intervalo, 900 pares de estímulos durante 15 min) para induzir LTD de acordo com protocolos já estabelecidos.
Nota: Use estes protocolos somente ao trabalhar em uma experimentação a longo prazo da depressão. - Registre o potencial de campo local para 1 h após HFS ou LFS, alternativamente.
- Exporte dados e analise o uso do software.
- Verifique a posição do eletrodo de gravação e estimulação, dando uma estimulação de 10 μA corrente por 30 s para a lesão das áreas gravadas. Perfuse transcardially o rato com o paraformaldeído de 4% e colha o cérebro cortando e manchando com violeta de Cresyl de acordo com.
- Eutanizar mouse por luxação cervical ou injeção de dosagem anestésica letal após experimento.
- Fixar e posicionar o eletrodo de estimulação e gravação firmemente no suporte estereotáxico. Ajuste o instrumento estereotáxico de acordo com a posição das coordenadas AP e ML correspondentes para os eletrodos de estimulação e gravação acima do hipocampo dorsal do CA1.
2. gravação de campo in vitro
- Preparando soluções de fatiamento oxigenado e fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
- Para 2 L de solução de fatiamento, adicione aproximadamente 1 L de água destilada dupla em um balão volumétrico e mexa vigorosamente em uma placa de agitador.
- Adicione os seguintes componentes da solução de fatiamento (em mM): 87,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2po4, 25,0 NaHCO3, 25,0 glucose, 75,0 sacarose, 7,0 MgCl2. 6h2o e 0,5 CAcl2∙ 2h2o (tabela 1).
Nota: Alternativamente, MgCl2∙ 6h2o e CAcl2∙ 2h2o pode ser excluído neste estágio e adicionado mais tarde em um pronto para usar o volume. - Top até 2 L com água destilada dupla enquanto mexendo vigorosamente.
- Para 2 L de ACSF, adicione aproximadamente 1 L de água destilada dupla em um balão volumétrico e mexa vigorosamente em uma placa de agitador.
- Adicione os seguintes componentes da solução ACSF (em mM): 125,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2po4, 25,0 NaHCO3, 25 glucose, 1,0 MgCl2∙ 6h2o e 2,0 CAcl2∙ 2h2o (tabela 1).
Nota: Alternativamente,MgCl 2. 6h2o e CAcl2∙ 2h2o pode ser excluído neste estágio e adicionado mais tarde em um pronto para usar o volume. - Top até 2 L com água destilada dupla enquanto mexendo vigorosamente.
- Configuração e corte cerebral
- Despeje 400 mL de solução de fatiamento já preparada em um balão separado e oxigenado (95% O2/5% co2) por aproximadamente 20 min.
- Guarde o resto da solução de 1,6 L num frigorífico de 4 ° c. Mantenha a solução até 1 semana após a qual deve ser descartada se não for usada para evitar o crescimento fúngico.
- Despeje 200 mL da solução de fatiamento oxigenada no balão, cubra com parafilm e transfira para um freezer de-80 ° c por aproximadamente 20 min para fazer uma lama.
- Despeje o restante 200 mL de solução de fatiamento em uma fatia de cérebro segurando câmara e manter em um banho de água de 32 ° c com borbulhagem contínua.
- Prepare o banco para fatiar. Coloque as toalhas de papel para baixo e ferramentas cirúrgicas em cima do banco. Organizar as ferramentas cirúrgicas em ordem de uso para facilitar um processo rápido e eficiente (Figura 7).
- Tire a solução de fatiamento refrigerada do congelador e despeje aproximadamente 50 mL em um copo. Despeje aproximadamente 10 mL em um prato de Petri contendo papel de filtro para umedecer. Coloque-os no gelo pela área de dissecção.
- Despeje o resto da solução de fatiamento sentimentaI na câmara de corte e corrigi-lo no vibratome.
- Anestesie o rato com isoflurano usando diretrizes e regulamentos sobre cuidados com os animais e uso do laboratório do Instituto Nacional de saúde, e os métodos aprovados do Comitê de uso e cuidado animal institucional da Universidade da cidade de Hong Kong e do nacional de Incheon Universidade.
- Decapitar o rato anestesiado com um par de tesouras e colocar a cabeça sobre papel tissue. Corte a pele cobrindo o crânio do mouse e corte através dos músculos cutâneos com tesouras. Corte as placas do crânio ao longo da linha média ao osso occipital usando tesouras cirúrgicas.
- Abra o crânio com fórceps sem corte para expor o cérebro. Retire suavemente o cérebro com uma espátula e coloque na solução de fatiar refrigerada no copo. Aguarde cerca de 30 s.
- Retire o cérebro usando a colher e coloque-o cuidadosamente no papel de filtro previamente umedecido na placa de Petri.
- Separe os dois hemisférios cerebrais ao longo da linha média com uma lâmina de bisturi. Isole o hipocampo delicadamente desanexando-o do córtex com uma espátula e coloque-o cuidadosamente no papel de filtro umedecido. Recorte a extremidade septal e temporal do hipocampo isolado usando o bisturi.
- Pegue o hipocampo isolado usando uma espátula sem corte e escova. Gentilmente DAB a espátula em um papel tissue para remover o excesso de água.
- Aplique uma pequena quantidade de cola à placa de corte do vibratome.
- Para uma fatia de hippocampal longitudinal CA1, anexar a região de i. do hipocampo para a placa de fatiamento com a cola. Rapidamente, mas cuidadosamente colocá-lo na câmara de corte do vibratoma contendo a solução de fatiamento oxigenado refrigerado.
- Para a fatia transversal que servirá como um controle, prenda a extremidade ventral do hipocampo à placa de fatiamento do vibratome. Rapidamente, mas cuidadosamente colocá-lo na câmara de corte contendo o resfriado solução de dissecção oxigenada.
Observação: esta etapa é uma alternativa para a etapa acima e deve ser executada separadamente. - Posicione o ângulo da lâmina em 90 °. Ajuste os parâmetros do do a uma velocidade de 0, 5 milímetros/s, uma amplitude de 1,20 milímetros e uma espessura da fatia de 400 μm.
- Corte o hipocampo anexado com o vibratome.
Nota: uma boa fatia longitudinal do cérebro do hipocampal CA1 terá uma camada de CA1 e 2 camadas de giro dentado. Um máximo de 2 boas fatias de hipocampal pode ser obtido. Alternativamente, uma fatia transversal do cérebro do hippocampal terá o giro dentate, as regiões de-e do CA1 e do CA1 intact. - Transfira as fatias longitudinais do cérebro do hippocampal do do com uma pipeta e incubar-a na câmara da terra arrendada da fatia do cérebro no banho de água.
- Incubar fatias no banho de água por 20 min a uma temperatura de 32 ° c e trazer para fora a temperatura ambiente para 30 min de recuperação.
Nota: Alternativamente, transfira a fatia do cérebro quando fora do banho de água e coloc delicadamente a na câmara de gravação com o fluxo oxigenado ACSF em uma temperatura de 32 ° c por 30 minutos da recuperação. - Enquanto incubando no banho de água, despeje 400 mL de solução de ACSF em um balão separado e oxigenar (95% O2/5% co2) por aproximadamente 20-30 min antes de transferir a fatia do cérebro para a câmara de gravação. Superfuse continuamente o ACSF na câmara de gravação a uma velocidade de 2 mL/min.
- Gire sobre o controlador de temperatura para aquecer o fluxo ACSF a 32 ° c.
- Guarde o resto da solução de 1,6 L num frigorífico de 4 ° c. Manter a solução até uma semana após a qual ele deve ser Descartado se não for usado para evitar o crescimento de fungos.
- Gravação in vitro
- Configure um equipamento de gravação ativando todos os hardwares necessários.
- Transfira a fatia do cérebro da câmara da terra arrendada da fatia na câmara de gravação. Ajuste a posição da fatia do cérebro com fórceps sem corte e segure-a no lugar com uma harpa. Permita que o ACSF funcione por pelo menos 20 minutos. Isso permite que a fatia do cérebro para ser estável antes de gravar.
- Encha a pipeta da gravação com o ACSF como uma solução interna.
- Verifique a resistência da pipeta de gravação com o software designado. A resistência da pipeta da gravação deve estar dentro da escala de 3-5 MΩ.
- Ative o software para aquisição de dados. Este software deve ter características similares que permitam a aquisição de dados de forma semelhante à das gravações in vivo mostradas anteriormente.
- Fixe a gravação e os eléctrodos de estimulação firmemente no suporte do instrumento estereotáxico. Coloque o eletrodo de referência no ACSF na câmara de gravação.
- Para as fatias longitudinais, posicione o eletrodo de estimulação e gravação no estrato Oriens (S.O.). Mantenha a distância entre eletrodos para cerca de 300 a 500 μm. Coloque o eletrodo de estimulação no lado septal ou temporal da fatia cerebral e grave da mesma camada (Figura 8).
- Alternativamente, posicione o eletrodo de estimulação e gravação no estrato radiatum (S.R.). Coloque o eletrodo de estimulação no lado septal ou temporal da fatia cerebral.
- Para as fatias transversais como um controle, posicione o eletrodo estimulante na região do (caminho colateral de Schaffer) e o eletrodo de gravação na região CA1 (Figura 9).
Observação: esta é uma etapa de controle alternativo e deve ser executada em um experimento separado. - Gire sobre o gerador isolado do estímulo e dê a estimulação (duração de 100 μs, repetida em intervalos de 30 s). Ajuste a profundidade do eletrodo de gravação e/ou posição até que um potencial de campo pós-sináptico excitatória evocado estável seja observado.
- Assegure-se de que um fEPSP estável estêve evocado variando a intensidade do estímulo. Uma mudança notável na inclinação do fEPSP deve ser observada com cada mudança da intensidade do estímulo. Isso é denominado como a curva de entrada-saída. Criar uma curva de entrada-saída (I-O) para detectar a intensidade máxima de estímulo na qual não há mais aumento na inclinação do FEPSP (Figura 6).
Nota: Descarte os dados e mude a posição do eletrodo se o vôlei de fibra desaparecer durante o experimento. - Use a curva de entrada-saída para definir a intensidade do estímulo para a gravação de linha de base e para evocar a estimulação de alta frequência (HFS) ou tétano para 30-40% do fEPSP evocado máximo.
- Alternativamente, para experimentos em relação a LTD, use a curva de entrada-saída para definir a intensidade da linha de base para a gravação de linha de base e para evocar a estimulação de baixa frequência (LFS) para 70% do fEPSP evocado máximo.
- Registre o potencial de campo local como a linha de base para 20-30 min.
- Aplique HFS de 100 Hz pulsos duas vezes com um intervalo de 30 s para induzir LTP.
- Alternativamente, para experimentos de LTD, aplique estimulação de baixa frequência de 5 Hz (900 estímulos durante 3 min) ou 1 Hz LFS (900 estímulos durante 15 min) ou 1 Hz emparelhado-pulso (50 ms emparelhado-pulso intervalo, 900 pares de estímulos durante 15 min) para induzir LTD de acordo com já protocolo estabelecido.
- Registre o potencial de campo local para 1 h após HFS ou LFS.
- Exporte dados e analise.
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Representative Results
Nós exploramos a plasticidade sináptica a longo prazo de neurônios piramidal do CA1 longitudinal do hipocampo usando gravações extracelular do campo ambos in vivo e in vitro. LTP e LTD são facetas da plasticidade sináptica de longo prazo que foram demonstradas no eixo transversal do hipocampo para ser unidirecional.
Nós mostramos aqui que usando fatias hippocampal longitudinais do cérebro, há LTP no eixo longitudinal CA1 do Hippocampus. Foram preparadas fatias longitudinais do hipocampo ao longo do eixo septotemporal, que é perpendicular às fatias transversais (Figura 1). Usando gravações da região CA1 do hipocampo, mostramos a presença de LTP que não era específica de direção. Não houve diferença estatisticamente significante nas gravações do lado septal ou temporal (Figura 2) da fatia longitudinal do cérebro hipocampal. Também mostramos a presença de LTP que não foi específica da camada; assim, as gravações do radiatum do estrato e dos Oriens do estrato (Figura 2) mostraram com sucesso LTP induzido na fatia longitudinal do cérebro. Utilizou-se D-AP5, antagonista de NMDAR para demonstrar que a LTP induzida era dependente de receptores NMDA (Figura 3). O que acontece in vitro não reflete necessariamente as condições in vivo, por isso investigamos a LTP in vivo. Figura 4 a mostra um diagrama esquemático do eletrodo de estimulação e gravação posicionado no hipocampo dorsal ao longo do eixo longitudinal da região CA1 in vivo. A posição dos eletrodos utilizados para o registro e estimulação foi verificada por meio de marcas de lesão e coloração violeta cristalina (Figura 4a). Demonstramos a presença de LTP in vivo na região de CA1 longitudinal (Figura 4b).
Usando protocolos já estabelecidos para induzir o LTD, nós não conseguimos induzir com sucesso o LTD in vivo e in vitro (Figura 5).
Figura 1 . Um desenho esquemático de fatias transversais e longitudinais do cérebro do hippocampal. Este número é adaptado e modificado de Sun et al. 201821. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . LTP em fatias longitudinais. As respostas sinápticas em S.R. (a) ou s.o. (b) em fatias longitudinais são potenciadas logo após a estimulação do tétano com entradas temporais e septais (s.r./temporal (n = 12, c), s.r./septal (n = 12, c), s.o./temporal (n = 10, d), s.o./septal (n = 9, d).
O n representa o número de fatias. Barras de erro representam SE. Este número é adaptado e modificado de Sun et al. 201821. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . LTP dependente de NMDAR em fatias longitudinais. (a,b) A indução da LTP no sentido temporal e septal é bloqueada por 50 μM D-AP5 (temporal, n = 6, a) (septal, n = 5, b). (c,d) A indução de LTP na direção temporal e septal também é bloqueada por D-AP5. O n significa fatias. Barras de erro representam SE. Este número é adaptado e modificado de Sun et al. 201821. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . In vivo LTP na rede interlamelar. (a) um desenho esquemático de eletrodos de gravação e estimulação em animais anestesiados. Os locos de gravação (no lado septal de CA1) e eletrodos estimulantes (no lado temporal da CA1) foram identificados por marcas de lesão. (b) LTP é induzido na conexão interlamelar pela estimulação de alta freqüência de 100 Hertz (HFS) (n = 10 ratos). Traços de cor: antes (preto) e depois (vermelho) HFS. Barras de erro representam SE. Este número é adaptado e modificado de Sun et al. 201821. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Ausência de in vivo e in vitro LTD na rede interlamelar CA1. (a) 1 Hz-PP LFS não induz in vivo Ltd. (b) 1 Hz PP-LTP, (c) 5 Hz LFS, e (d) 1 Hz LFS não produzem Ltd em ambos os lados temporais ou septal da fatia longitudinal do cérebro. enquanto LTD é induzida por 1 Hz PP-LFS em fatias transversais: temporal (n = 8), septal (n = 11) e transversal (n = 6) com 1 Hz PP-LFS; temporal (n = 3) e septal (n = 3) com 5 Hz LFS; temporal (n = 3) e septal (n = 3) com 1 Hz LFS. O n significa fatias. Barras de erro representam SE. Este número é adaptado e modificado de Sun et al. 201821. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Curva da entrada-saída que apresenta a inclinação de fEPSP em resposta à entrada crescente do estímulo na fatia hippocampal do cérebro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 . Ferramentas cirúrgicas usadas para a isolação hippocampal durante o corte in vitro do cérebro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 . Uma fatia longitudinal do cérebro pronta para A gravação. Eletrodo de estimulação e pipeta de gravação são inseridos no estrato radiatum. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 . Uma fatia transversal do cérebro do hippocampal pronta para gravar. O elétrodo da estimulação é introduzido na região da garantia de Schaffer e o do de gravação é introduzido na região CA1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composto | Fatiando a solução (milímetro) | ACSF (milímetro) |
| CaCl2. 2h2O | 0,5 | 2 |
| Glicose | 25 | 25 |
| Kcl | 2,5 | 2,5 |
| MgCl2. 6h2O | 7 | 1 |
| Nacl | 87 | 125 |
| NaH2po4 | 1,3 | 1,3 |
| NaHCO3 | 25 | 25 |
| Sacarose | 75 |
Tabela 1: concentrações de compostos em fatia cerebral e soluções de fluido cefalorraquidiano artificial.
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Discussion
O protocolo demonstra o método para induzir a plasticidade sináptica a longo prazo in vivo, bem como de fatias cerebrais no eixo CA1-CA1 longitudinal do hipocampo in vitro. As etapas esboçadas dão bastante detalhes para que um experimentador investigue LTP e LTD em uma conexão de CA1-CA1 hippocampal longitudinal. A prática é necessária para aprimorar as habilidades necessárias para registrar com sucesso os potenciais excitatórios de campo.
Além da necessidade de prática, existem várias etapas críticas que são essenciais para a obtenção de bons resultados. Primeiramente, mostrou-se previamente que o ângulo a que as fatias do cérebro foram feitos poderia ou truncar ou preservar as projeções longitudinais dos neurônios piramidal na região CA1-CA1 do hipocampo16. Os neurônios piramidais longitudinais projetam dos neurônios transversais em um ângulo que seja quase perpendicular. Como os neurônios CA1 se propagam em diversos ângulos dentro do hipocampo, a conexão longitudinal entre eles estabelece ao longo do eixo dorsoventral do hipocampo. Assim, para a gravação in vitro, o experimentador deve manter isso em mente para direcionar com precisão os neurônios do hipocampal CA1-CA1 ao longo do eixo longitudinal cortando o tecido do hipocampo isolado ao longo do eixo dorsal-ventral. Além disso, para gravações in vivo, o ângulo em que a estimulação e os eletrodos de gravação são posicionados determina se os resultados obtidos são representativos do eixo longitudinal ou uma mistura do eixo transversal e longitudinal. Outras investigações que utilizem CRISPR-Cas9 podem ser feitas para confirmar se a resposta evocada é unicamente da região CA1, uma vez que pode ser uma mistura de respostas tanto do CA1 quanto das regiões de o de-i.
Em segundo lugar, para experimentos in vitro, o experimentador deve garantir que a solução de fatiamento cerebral, ACSF, bancada de trabalho e todos os equipamentos ou instrumentos que entram em contato com a fatia cerebral estão livres de contaminantes. Qualquer forma de contaminação levará à deterioração da integridade ou morte da fatia cerebral. Manter uma superfície limpa do elétrodo assegurará gravações boas e estáveis para experimentos in vitro e in vivo.
Mostramos que a rede longitudinal do hipocampal CA1 exibe LTPs dependentes de NMDAR, mas não LTDs. O circuito trisynaptic, entretanto, apresenta com LTP e Ltd22,23. Isto implica que a rede de CA1 longitudinal e os circuitos Tri-sinápticos têm características únicas. Nosso protocolo faz uso de apenas gravações eletrofisiológicas e, portanto, é limitado em encontrar a diferença entre essas duas redes.
A busca de uma cura para doenças cerebrais como a esquizofrenia continua. O declínio ou a deformidade de subregiões de CA1 hippocampal foram lig com alguns sintomas esquizofrênicos24,25. A aplicação do nosso protocolo, embora básico, trouxe à luz uma capacidade sináptica única da subregião hipocampal longitudinal CA1. Este conhecimento é útil na concepção de experimentos que podem investigar ainda mais esta doença cerebral debilitante ao longo do eixo CA1 longitudinal do hipocampo.
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Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Universidade Nacional de Incheon (cooperativa internacional) Research Grant. Gostaríamos de agradecer a Sra. gona Choi por ajudar com alguma coleta de dados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline | Sigma-Aldrich | 5908-99-6 | Stored in Dessicator |
| Axon Digidata 1550B | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Clampex 10.7 | |||
| D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Eyegel | Dechra | ||
| Isoflurane | RWD Life Sciences | R510-22 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| Matrix electrodes, Tungsten | FHC | 18305 | |
| Multiclamp 700B Amplifier | |||
| Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99% | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | Stored in Dessicator |
| Pump | Longer precision pump Co., Ltd | T-S113&JY10-14 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 63148-62-9 | |
| Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5% | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT) | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic, powder | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sucrose, ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | |
| Temperature controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Tungsten microelectrodes | FHC | 20843 | |
| Urethane, ≥99% | Sigma-Aldrich | 51-79-6 | |
| Vibratome | Leica | VT-1200S | |
| Water bath | Grant Instruments | SAP12 |
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