Cet article décrit un simple test basé sur PCR pour surveiller l’activité d’un rétrotransposon line-1 actif et pour cartographier les rétrotranspositions de novo dans un génome donné. À l’aide de la lignée cellulaire MCF7, nous démontrons ici comment cette méthode peut être appliquée pour détecter l’activité d’une ligne-1 située au 22q12.1.
Les éléments nucléaires entrecoupés de longue durée 1 (LINE-1) sont la seule famille d’éléments génétiques mobiles dans le génome humain qui peuvent se déplacer de façon autonome. Ils le font par un processus appelé rétrotransposition dans lequel ils transcritnt pour former un intermédiaire arnasquie qui est ensuite inséré dans le génome par transcription inversée. En dépit d’être silencieux dans les cellules normales, les LINE-1 sont fortement actifs dans différentes tumeurs épithéliales. De novo (En) Les insertions de LINE-1 peuvent potentiellement conduire la tumorigénèse, et il est donc important d’étudier systématiquement la rétrotransposition LINE-1 dans le cancer. Sur les 150 LINE-1 compétents en rétrotransposition présents dans le génome humain, seule une poignée de loci LINE-1, également appelés LINE-1 « chauds », représentent la majorité de l’insertion de novo LINE-1 dans différents types de cancer. Nous avons développé une méthode simple basée sur la réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour surveiller l’activité de rétrotransposition de ces LIGNES-1 chaudes. Cette méthode, basée sur l’inverse de longue distance (LDI)-PCR, tire parti de la transduction de 3 euros, un mécanisme par lequel une LIGNE-1 mobilise sa région non répétitive, qui peut ensuite être utilisée pour identifier les événements de transduction novo LINE-1 3 provenant d’une ligne-1 chaude particulière.
Les éléments nucléaires entrecoupés de longue durée (LINE-1) sont une famille d’éléments génétiques mobiles appelés rétrotransposons qui peuvent se déplacer indépendamment d’un endroit à l’autre par l’intermédiaire d’un mécanisme de copier-coller appelé rétrotransposition. Au fil du temps, le génome humain a accumulé plus de 500 000 copies de LINE-1 répète1. Cependant, la plupart des copies LINE-1 présentes dans le génome sont mutées et ne peuvent donc pas se déplacer par rétrotransposition; seulement 150 exemplaires ont une copie intacte de la séquence d’ADN nécessaire pour qu’ils se déplacent2. Dans les cellules somatiques normales, la mobilité de ces LINE-1 est limitée par différents facteurs d’hôte3. Ces restrictions sont soulagées dans différentes tumeurs épithéliales, causant des LINE-1 pour être déprimées et ayant pour résultat de nombreuses insertions de novo dans le génome de tumeur4. Certaines de ces insertions de novo associées à la tumeur ont été montrées pour causer la mutagénèse insertionnelle dans les gènes, conduisant ainsi la progression de tumeur5,6. Par conséquent, il est important d’être en mesure de cartographier de nouvelles insertions dans le génome de la tumeur.
Méthodes existantes pour détecter de novo LINE-1 insertions utilisation (1) approche de séquençage du génome entier4,7,8, où différents algorithmes de calcul sont utilisés pour trouver de novo LINE-1 insertions à partir des données WGS, ou (2) séquençage de nouvelle génération qui cible la fin de 3 ‘de jeunes, potentiellement actifs LINE-1s9,10,11,12,13. Cependant, trouver de nouvelles insertions parmi plusieurs milliers de copies quasi identiques avec ces méthodes est loin d’être trivial, et le défi est encore aggravé par l’hétérogénéité tumorale et les altérations génomiques associées à l’insertion LINE-14.
Des études utilisant ces méthodes existantes ont montré que seulement quelques LINE-1 représentent la majorité des insertions de novo LINE-1 observées dans les tumeurs7,8. Par conséquent, pour répondre si oui ou non un échantillon de tumeur particulier affiche l’activité LINE-1, il suffit de cartographier les événements de rétrotransposition causés par cette poignée de loci LINE-1 très actif. Dans cet article, nous décrivons une simple méthode14 basée sur la réaction en chaîne de polymérase (PCR) qui peut être utilisée pour surveiller l’activité d’un locus particulier de LINE-1 dans le premier intron du gène TTC28 à 22q12.1 qui est fortement actif dans le cancer colorectal 7 Annonces , 8. Ce locus LINE-1 sera appelé TTC28-LINE-1 tout au long de l’article. Cet exemple identifie spécifiquement les événements de rétrotransposition de novo LINE-1 qui mobilisent des séquences non répétitives sur la région de 3 flancs de la source LINE-1 par un mécanisme appelé 3 ‘transduction15. 3 – la transduction se produit en raison du faible signal de polyadenylation LINE-1 (PAS) qui fait sauter la machinerie transcriptionnelle et de mettre fin à la transcription à la PLUS forte PAS en aval, capturant ainsi la séquence non répétitive de flanc ( désormais appelée « balise unique ») qui est ensuite insérée dans l’emplacement cible le long de la séquence LINE-1. Philippe et coll.16 ont récemment montré que différents types de cellules peuvent exprimer différents loci LINE-1. À la lumière de cette constatation, cette méthode peut être appliquée pour surveiller l’activité de la ligne-1 la plus fortement exprimée qui mobilisent leur étiquette unique dans le type d’intérêt de cancer.
La première étape de LDI-PCR est la digestion de l’ADN génomique avec une enzyme de restriction qui génère un fragment de restriction contenant le LINE-1 étant évalué (ici, TTC28-LINE-1) et son étiquette unique (Figure 1). L’ADN digéré est ensuite circularisé par auto-ligation et PCR amplifié à l’aide d’amorces inverses situées dans l’étiquette unique. Ce faisant, la source pleine longueur LINE-1 à son emplacement “indigène” est toujours amplifiée et à côté d’elle, les insertions LINE-1 de progéniture à différents loci cibles contenant l’étiquette unique seront également amplifiées (figure 1), rapportant ainsi l’activité de rétrotransposition du LINE-1 en question.
Ici, nous décrivons une méthode qui peut être utilisée pour identifier les insertions de novo LINE-1 provenant de toute ligne active-1 d’intérêt. Nous avons optimisé cette méthode pour un LINE-1 très actif, situé à 22q12.1, et précédemment démontré qu’il est très sensible dans la détection des insertions sous-clonales dans le cancer colorectal14.
Le succès du LDI-PCR dépend de la qualité de l’ADN génomique. Par conséquent, nous avons inclus une étape supplémentaire de contrôle de la qualité pour nous assurer qu’au début du protocole, l’ADN de poids moléculaire élevé est présent (étape 2.1.2). Nous vous recommandons de stocker l’ADN génomique à -20 oC pour le stockage à long terme, et de préparer les aliquots afin d’éviter les cycles de congélation et de décongélation. L’utilisation de l’ADN génomique provenant du sang ou du tissu normal apparié par le patient est fortement recommandée pour distinguer si la rétrotransposition LINE-1 détectée est une lignée germinale ou un événement somatique. Étant donné que les sites de coupe pour les enzymes de restriction sont stochastiques dans le génome, il est possible qu’un site particulier d’insertion de novo LINE-1 ne puisse pas abriter de sites de coupe pour l’enzyme de restriction utilisée à proximité. Par conséquent, pour augmenter la probabilité de détecter la majorité des insertions de novo LINE-1 dans l’ADN tumoral, plus d’une enzyme de restriction devrait être utilisée dans des réactions distinctes pour générer différentes bibliothèques de modèle d’ADN circulaire. En outre, si l’étiquette unique de la LIGNE-1 d’intérêt a plus d’un PAS, puis l’utilisation de paires d’apprêt adjacentes à chaque PAS améliore les chances de détecter les transductions fortement tronquées.
Bien qu’il existe des méthodes élégantes pour la détection à l’échelle du génome des insertions de novo LINE-1, elles peuvent être écrasantes si l’objectif est de sonder la compétence de rétrotransposition d’une ligne-1 particulière dans un contexte cellulaire spécifique. À cette fin, LDI-PCR peut être une approche peu coûteuse et simple mais robuste pour visualiser les événements de rétrotransposition LINE-1. L’approche de ciblage utilisée dans cette méthode est similaire à TS-ATLAS22; cependant, LDI-PCR évite d’utiliser des oligonucléotides de liaison et peut amplifier simultanément les jonctions de 5 et 3 jonctions de l’insertion de novo LINE-1. Les informations concernant les deux jonctions de 5 et 3 de l’insertion LINE-1, le site cible de l’intégration, la queue polyA et les modifications du site cible, qui sont toutes des caractéristiques de la rétrotransposition LINE-1, peuvent être obtenues en couplant LDI-PCR avec une seule molécule technologies de séquençage à lecture longue. Les longues lectures ainsi générées contiennent la séquence LINE-1 insérée, son balise unique et les séquences cibles en une seule lecture, contournant les difficultés de cartographie des lectures courtes dans la région répétitive.
Il y a deux limitations majeures à l’utilisation de LDI-PCR pour la détection de l’activité LINE-1. La première est inhérente au PCR : elle ne peut amplifier de manière fiable les fragments jusqu’à 10 kb. Ceci devrait être pris en considération lors de la sélection de l’enzyme de restriction(s), comme le fragment indigène ne doit pas dépasser cette limite. Deuxièmement, cette méthode ne peut détecter que les événements de rétrotransposition qui mobilisent la région de 3 côtés de la LIGNE-1 par 3 transductions. Par conséquent, l’activité des LIGNES-1 qui ne présentent pas la transduction de 3 euros ne sera pas détectée à l’aide de cette méthode. De plus, bien qu’ils soient amplifiés par le LDI-PCR, certains événements de rétrotransposition LINE-1 qui (a) génèrent une cible DE PCR de taille similaire à l’emplacement « natif » ou à d’autres rétrotranspositions ou (b) sont rares ou sous-clonaux, peuvent ne pas être détectés par le gel d’agarose Électrophorèse. De tels événements de rétrotransposition LINE-1 peuvent être capturés en séquençant le produit LDI-PCR à l’aide de technologies de séquençage à lecture longue molécule unique14.
Le flux de travail décrit ici peut être facilement modifié pour détecter l’activité d’autres LINE-1 « chauds » en utilisant une enzyme de restriction appropriée et en concevant des amorces inverses ciblant ces LINE-1. En plus de la détection de la transduction de 3 -de la ligne-1, cette méthode peutêtre adaptée pour détecter les transductions de 5 ‘5 ‘par i de la ligne-1 moins fréquentes. Une méthode similaire a été utilisée pour identifier le site d’intégration des journalistes de LINE-1 dans les essais cellulaires24 et les sites d’intégration provirale dans le cancer25. Outre les insertions LINE-1, cette méthode peut également être utilisée pour détecter d’autres aberrations génomiques, telles que les réarrangements d’ADN, où l’information concernant la région sujette au réarrangement préexiste26.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier tous nos co-auteurs dans l’article où cette méthode a été décrite pour la première fois14, en particulier Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara et Esa Pitkunen pour des discussions précieuses tout en développant la méthode. L.K. est financé par l’Académie de Finlande (numéros de subvention 25996, 292789, 306026 et 314394), la Fondation Sigrid Juselius et la Société finlandaise du cancer. B.P. est titulaire d’un doctorat de la Fondation de recherche de l’Université d’Helsinki, d’une bourse de thèse de la Société finlandaise du cancer et d’une bourse de recherche doctorale d’Ida Montinin Sôtiô. Nous remercions également Teemu Masalin (Université d’Helsinki) et Kul Shrestha du groupe de recherche de L.K. de nous avoir aidés dans la production vidéo.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |