Dit artikel schetst een eenvoudige PCR-gebaseerde assay om de activiteit van een actieve lijn-1 retrotransposon te monitoren en de Novo retrotransposities in een gegeven genoom in kaart te kunnen krijgen. Met behulp van de MCF7 cellijn tonen we hierin hoe deze methode kan worden toegepast om de activiteit van een lijn-1 te detecteren op 22q 12.1.
Lang afgewisseld nucleaire elementen 1 (lijn-1s) zijn de enige familie van mobiele genetische elementen in het menselijk genoom die autonoom kunnen bewegen. Zij doen dit door een proces dat retrotransponering wordt genoemd, waarin zij transcriberen om een mRNA-tussenproduct te vormen, dat vervolgens door omgekeerde transcriptie in het genoom wordt ingebracht. Ondanks dat het stil is in normale cellen, zijn LINE-1S zeer actief in verschillende epitheliale tumoren. De Novo LINE-1 inserties kan mogelijk tumorigenesis rijden, en daarom is het belangrijk om systematisch te bestuderen lijn-1 retrotransponering in kanker. Uit ~ 150 retrotransponering-bevoegde lijn-1S aanwezig in het menselijk genoom, slechts een handvol lijn-1 loci, ook wel aangeduid als “hot” lijn-1S, rekening voor de meerderheid van de Novo line-1 inbrengen in verschillende kankersoorten. We hebben een eenvoudige polymerase chain reaction (PCR) gebaseerde methode ontwikkeld om de retrotransponerings activiteit van deze Hot LINE-1S te monitoren. Deze methode, gebaseerd op de lange afstand inverse (LDI)-PCR, maakt gebruik van 3 ́ transductie, een mechanisme waarmee een lijn-1 zijn flankerende niet-repetitieve regio mobiliseert, die vervolgens kan worden gebruikt om de Novo line-1 3 ́ transductie events te identificeren die voortvloeien uit een bepaalde Hot LINE-1.
Lang afgewisseld nucleaire elementen (lijn-1s) zijn een familie van mobiele genetische elementen genaamd retrotransposons die zelfstandig van de ene plaats naar de andere kunnen verhuizen via een Kopieer-en-plak mechanisme genaamd retrotransponering. In de evolutionaire tijd heeft het menselijk genoom meer dan 500.000 exemplaren van lijn 1 herhalingen1opgebouwd. De meeste van de in het genoom aanwezige lijn 1-exemplaren zijn echter gemuleerd en kunnen dus niet worden verplaatst via retrotransponering; slechts ~ 150 exemplaren hebben een intacte kopie van de DNA sequentie die nodig is om te bewegen2. In normale somatische cellen wordt de mobiliteit van deze lijn-1S beperkt door verschillende hostfactoren3. Deze beperkingen zijn opgelucht in verschillende epitheliale tumoren, waardoor lijn-1S worden ontlast en resulterend in veel de Novo inserties in de tumor genoom4. Sommige van deze tumor-geassocieerde de Novo inserties is aangetoond dat insertionele mutagenese in genen veroorzaken, vandaar het stimuleren van de tumorprogressie5,6. Daarom is het belangrijk om te kunnen toewijzen van nieuwe inserties in het tumor genoom.
Bestaande methoden voor het detecteren van de Novo line-1 inserties gebruik (1) Whole-genoom sequencing aanpak4,7,8, waarbij verschillende computationele algoritmen worden gebruikt om de Novo line-1 inserties te vinden van WGS-gegevens, of (2) sequentiëren van de volgende generatie die gericht is op de 3 ‘ einde van jonge, potentieel actieve lijn-1S9, 10,11,12,13. Het vinden van nieuwe inserties tussen enkele duizend bijna identieke kopieën met deze methoden is echter verre van triviaal, en de uitdaging wordt verder verergerd door tumor heterogeniteit en genomische veranderingen in verband met LINE-1 insertion4.
Studies met behulp van deze bestaande methoden toonden aan dat slechts een paar line-1S rekening voor de meerderheid van de Novo line-1 inserties waargenomen in tumoren7,8. Daarom, om te beantwoorden of een bepaald tumor monster lijn 1-activiteit weergeeft, volstaat het om de retrotransponerings gebeurtenissen in kaart te plaatsen, veroorzaakt door dit handvol zeer actieve lijn-1 loci. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige polymerase kettingreactie (PCR) gebaseerde methode14 die kan worden gebruikt om de activiteit van een bepaalde lijn te monitoren-1 Locus in het eerste intron van het TTC28 gen op 22q 12.1 dat zeer actief is in colorectale kanker 7 , 8. deze lijn-1 Locus zal worden aangeduid als TTC28-line-1 in het hele artikel. Deze bepaling identificeert specifiek de Novo line-1 retrotransponerings gebeurtenissen die niet-repetitieve sequenties op de 3 ‘ flankerende regio van de bron lijn-1 mobiliseren door een mechanisme genaamd 3 ́ transductie15. 3 ́ transductie treedt op als gevolg van het zwakke LINE-1 polyadenylatie signaal (PAS) dat ervoor zorgt dat de transcriptionele machines het overslaan en om in plaats daarvan transcriptie te beëindigen op het sterkere PAS stroomafwaarts, waardoor de flankerende niet-repetitieve sequentie wordt vastgelegd ( hierna aangeduid als de “unieke tag”) die vervolgens wordt ingevoegd in de doellocatie naast de lijn-1-reeks. Philippe et al.16 toonde onlangs aan dat verschillende CELTYPEN verschillende lijn-1 loci kunnen uitdrukken. In het licht van deze bevinding, deze methode kan worden toegepast om de activiteit van de meest uitgesproken lijn-1 die hun unieke tag in de kankersoort van belang mobiliseren te bewaken.
De eerste stap in LDI-PCR is de vertering van genomisch DNA met een restrictie-enzym dat een restrictie fragment genereert met de lijn-1 die wordt getest (hier, TTC28-line-1) en zijn unieke tag (Figuur 1). Verteerd DNA wordt dan gecircuariseerd door zelf-ligatie en PCR versterkt met behulp van inverse primers gelegen binnen de unieke tag. Door dit te doen, wordt de volledige bron lijn-1 op zijn “native” locatie altijd versterkt en ernaast worden nakomelingen LINE-1-inserties op verschillende doel loci met de unieke tag ook versterkt (Figuur 1), waardoor rapportage de retrotransponerings activiteit van de betrokken lijn 1.
Hier beschrijven we een methode die kan worden gebruikt om de Novo line-1 inserties te identificeren die voortvloeien uit elke actieve lijn-1 van belang. We hebben deze methode geoptimaliseerd voor een zeer actieve lijn-1, gelegen op 22q 12.1, en eerder aangetoond dat het zeer gevoelig zijn bij het opsporen van sub-klonale inserties in colorectale kanker14.
Succes van LDI-PCR is afhankelijk van de kwaliteit van het genomische DNA. Daarom hebben we een aanvullende kwaliteitscontrole stap opgenomen om ervoor te zorgen dat bij het begin van het protocol het DNA van hoog moleculair gewicht aanwezig is (stap 2.1.2). We raden aan om genomisch DNA bij-20 °C op te slaan voor lange termijn opslag, en om aliquots voor te bereiden om cycli van invriezen en ontdooien te voorkomen. Het gebruik van genomisch DNA uit bloed of door de patiënt overeenkomend normaal weefsel wordt ten zeerste aanbevolen om te onderscheiden of de waargenomen lijn-1 retrotransponering een kiembaan of een somatische gebeurtenis is. Aangezien cut-sites voor restrictie enzymen stochastisch zijn in het genoom, is het mogelijk dat een bepaalde de Novo line-1 insertion site geen snij plekken kan plaatsen voor het restrictie-enzym dat in zijn omgeving wordt gebruikt. Vandaar om de kans op het detecteren van de meerderheid van de Novo line-1 inserties in tumor DNA te verhogen, meer dan één restrictie enzym moet worden gebruikt in afzonderlijke reacties om verschillende bibliotheken van circulaire DNA-sjabloon te genereren. Bovendien, als de unieke tag van de lijn-1 van belang meer dan één PAS heeft, dan verbetert het gebruik van primer paren naast elk PAS de kans op het detecteren van zwaar afgeknotte transducties.
Hoewel er elegante methoden voor genoom-brede detectie van de Novo line-1 inserties bestaan, kunnen ze overweldigend zijn als het doel is om de competentie voor retrotransponering van een bepaalde lijn-1 in een specifieke cellulaire context te peilen. Voor dit doel kan LDI-PCR een goedkope en eenvoudige maar robuuste benadering zijn om lijn 1-retrotransponerings gebeurtenissen te visualiseren. De targetingbenadering die in deze methode wordt gebruikt, is vergelijkbaar met TS-ATLAS22; echter, LDI-PCR vermijdt het gebruik van linker oligonucleotiden en kan zowel 5 ́ en 3 ‘ kruispunten van de Novo line-1 insertion gelijktijdig versterken. Informatie over zowel 5 ́ als 3 ‘ knooppunten van de lijn-1 invoeging, de doelsite van integratie, polyA tail en target-site modificaties, die allemaal kenmerkend zijn voor lijn-1 retrotransponering, kan worden verkregen door koppeling LDI-PCR met enkelvoudig molecuul sequentiëren van lange leesvolgorde technologieën. Lange leest aldus gegenereerde bevatten de ingevoegde lijn-1 sequentie, de unieke tag en de doel sequenties in één enkele lezen, het omzeilen van moeilijkheden van het in kaart brengen van korte leesbewerkingen in de repetitieve regio.
Er zijn twee belangrijke beperkingen voor het gebruik van LDI-PCR voor detectie van lijn 1-activiteit. De eerste is inherent aan PCR: het kan alleen betrouwbaar versterken fragmenten tot 10 KB groot. Dit moet worden overwogen tijdens het selecteren van restrictie-enzym (s), omdat het oorspronkelijke fragment deze limiet niet mag overschrijden. Ten tweede kan deze methode alleen retrotransponerings gebeurtenissen detecteren die de 3 ́ flankerende regio van de lijn 1 door 3 ‘ transducties mobiliseren. Vandaar, activiteit van die lijn-1S die niet vertonen 3 ́ transductie zal niet worden gedetecteerd met behulp van deze methode. Bovendien, ondanks het feit dat ze worden versterkt door LDI-PCR, zijn sommige lijn-1 retrotransponerings gebeurtenissen die (a) een PCR-doel van vergelijkbare grootte als de “inheemse” locatie of andere retrotransposities genereren of (b) zeldzaam of subclonal zijn, niet te detecteren door agarose gel Elektroforese. Dergelijke LINE-1 retrotransponerings gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd door de sequencing van het LDI-PCR-product met behulp van één molecuul met lange leesvolgorde technologieën14.
De hier beschreven workflow kan eenvoudig worden aangepast om de activiteit van andere “hot” LINE-1S te detecteren met behulp van een geschikt restrictie-enzym en door het ontwerpen van inverse primers die gericht zijn op deze lijn-1S. Naast de detectie van lijn-1 gemedieerde 3 ́ transductie, kan deze methode worden aangepast om minder frequente lijn-1 gemedieerde 5 ́ transductions23te detecteren. Vergelijkbare methode is gebruikt voor het identificeren van de integratie site van line-1 verslaggevers in cel gebaseerde assays24 en proviral integratie sites in Cancer25. Naast lijn-1 inserties, deze methode kan ook worden gebruikt voor het detecteren van andere genomische aberraties, zoals DNA-herschikking, waar informatie over de herschikkingen-gevoelige regio pre-bestaat26.
The authors have nothing to disclose.
We willen al onze medeauteurs bedanken in het artikel waarin deze methode voor het eerst werd beschreven14, vooral Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara en ESA Pitkänen voor waardevolle discussies tijdens het ontwikkelen van de methode. L.K. wordt gefinancierd door de Academie van Finland (Grant nummers 25996, 292789, 306026 en 314394), de Sigrid Juselius Foundation en de Finse Kankervereniging. Hij is de ontvanger van het doctoraatsdiploma van de University of Helsinki Research Foundation, een proefschrift voor de Finse Kankervereniging en een promotieonderzoek van IDA Montinin Säätiö. We danken ook Teemu Masalin (Universiteit van Helsinki) en KUL Shrestha van L.K. Research Group om ons te helpen met de videoproductie.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |