מאמר זה מתאר מבנה פשוט המבוסס על ה-PCR כדי לנטר את הפעילות של כריכת שורות פעילה של קו 1 וכדי למפות דה נובו בגנום נתון. באמצעות קו התא MCF7, אנו מדגימים בזאת כיצד ניתן להחיל שיטה זו כדי לזהות פעילות של קו -1 ממוקם ב 22q 12.1.
לונג בתוספת אלמנטים גרעיניים 1 (קו -1) הם המשפחה היחידה של אלמנטים גנטיים ניידים בגנום האנושי שיכול לנוע באופן עצמאי. הם עושים זאת על ידי תהליך הנקרא retroטרנספוזיציה שבו הם מתעתור כדי ליצור ביניים mRNA אשר אז מוכנס כתוצאה מכך הגנום על ידי תמלול הפוכה. למרות היותו שקט בתאים נורמליים, LINE-1s פעילים מאוד גידולים אפיתל שונים. דה נובו LINE-1 הוספות יכול פוטנציאלי לנסוע tumorigenesis, ולכן חשוב בשיטתיות לחקור את קו 1 הרטרווזיציה בסרטן. מתוך ~ 150 retroטרנספוזיציה-קו מוסמך-1s נוכח הגנום האנושי, רק קומץ של המקום קו -1, המכונה גם “חם” קו -1, חשבון עבור רוב ההכנסה קו-1 של דה נובו בסוגי סרטן שונים. פיתחנו תגובת שרשרת פולימראז פשוטה (PCR) מבוססי שיטה כדי לפקח על פעילות הרטרוטרנספוזיציה של אלה שורה חם-1s. שיטה זו, המבוססת על מרחק הפוך (LDI)-PCR, מנצלת 3 התמרה, מנגנון שדרכו קו -1 מגייס את האזור שאינו חוזר על עצמו, שניתן להשתמש בו לזיהוי אירועי התמרה של קו נובו -1 3 שמקורם בקו חם מסוים -1.
לונג שונים אלמנטים גרעיניים (LINE-1s) הם משפחה של אלמנטים גנטיים ניידים הנקרא retrotransposons שיכולים באופן עצמאי לעבור ממקום אחד למשנהו באמצעות מנגנון העתקה והדבקה הנקרא retroטרנספוזיציה. במשך הזמן האבולוציוני, הגנום האנושי צבר יותר מ 500,000 עותקים של קו -1 חוזר על1. עם זאת, רוב העותקים קו -1 הנמצאים בגנום הם מוטציה ולכן לא יכול לעבור דרך הרטרוטרנספוזיציה; רק ~ 150 עותקים יש עותק שלם של רצף ה-DNA הדרושים להם לעבור2. בתאים סומטיים נורמליים, הניידות של השורה האלה מוגבלת על-ידי גורמים מארחים שונים3. הגבלות אלה משוחררת גידולים אפיתל שונים, גורם קו -1 כדי להיות הלחץ וכתוצאה מכך הוספות דה נובו רבים בגנום הגידול4. חלק הוספות אלה הקשורים הגידול דה נובו הוכחו לגרום insertional מוטגנזה בגנים, ולכן נהיגה התקדמות הגידול5,6. לכן, חשוב להיות מסוגל למפות הוספות רומן בגנום הגידול.
שיטות קיימות כדי לזהות הוספות דה נובו קו -1 השימוש (1) הגנום כל רצף גישה4,7,8, שבו אלגוריתמים שונים בחישוב משמשים כדי למצוא את הוספות דה נובו LINE-1 מ-wgs נתונים, או (2) רצף הדור הבא מטרות 3 הקצה של צעיר, פוטנציאלי שורה-1s9,10,11,12,13. עם זאת, מציאת הוספות הרומן בקרב כמה אלפי עותקים כמעט זהה עם שיטות אלה רחוקה טריוויאלי, ואת האתגר הוא עוד יותר מחמירות על ידי טרוגניות הגידול שינויים גנומית הקשורים קו -1 הוספת4.
מחקרים באמצעות שיטות קיימות אלה הראו כי רק כמה שורה-1s חשבון עבור רוב של דה נובו קו 1 הוספות נצפתה בגידולים7,8. לכן, כדי לענות אם מדגם גידול מסוים מציג פעילות LINE-1, זה מספיק כדי למפות את אירועי הרטרוטרנספוזיציה שנגרמו מקומץ זה של המקום הפעיל ביותר של קו 1. במאמר זה, אנו מתארים תגובת שרשרת פולימראז פשוטה (PCR) מבוססי שיטה14 כי ניתן להשתמש כדי לנטר את הפעילות של מקום מסוים קו 1 ב אינטרון הראשון של הגן TTC28 ב 22q 12.1 כי הוא פעיל מאוד בסרטן המעי הגס מיכל סבן , 8. זה לוקוס קו 1 יהיה מכונה TTC28-line-1 לאורך המאמר. הדבר מזהה במפורש את האירועים של דה נובו line-1 משנה את ההתרחשויות המונעות רצף לא חוזר על האזור הנמצא במיקום המקורי של קו 1 על ידי מנגנון הנקרא 3 התמרה15. 3 התמרה מתרחשת בשל האות החלשה קו 1 פוליאדלציה (PAS) הגורמת מכונות הטרנססקריפט לדלג על זה ובמקום זאת לסיים שעתוק על PAS חזק במורד, ובכך לכידת האגף הלא חוזרים החוצה ( מעתה ואילך המכונה “תג ייחודי”) אשר מוכנס למיקום היעד לצד רצף קו -1. פיליפ ואח ‘16 לאחרונה הראה כי סוגי תאים שונים יכולים לבטא את המקום האחר LINE-1. לאור ממצא זה, ניתן להחיל שיטה זו כדי לפקח על הפעילות של קו -1 ביטוי ביותר המתגייס את התגית הייחודית שלהם לסוג העניין של הסרטן.
הצעד הראשון ב-LDI-PCR הוא העיכול של דנ א גנומית עם אנזים הגבלה המייצר קטע מגבלה המכיל את קו -1 להיות המאייד (כאן, TTC28-LINE-1) ואת התגית הייחודית שלה (איור 1). ה-DNA מתעכל לאחר מכן מעגליות על ידי הארכה עצמית ו-PCR מוגבר באמצעות כלים בצבעי היסוד ההופכי ממוקם בתוך תג ייחודי. על-ידי כך, המקור באורך מלא-1 במיקום “יליד” שלה הוא תמיד מוגבר ולצידו, שורה הצאצאים 1 הוספות במקום מטרה שונה המכיל את התג הייחודי יהיה גם הוגדל (איור 1), ובכך לדווח הפעילות הרטרודשנה של קו 1 המדובר.
כאן אנו מתארים שיטה שבה ניתן להשתמש כדי לזהות הוספות דה נובו line-1 הנובעים כל שורה פעילה 1 של ריבית. יש לנו אופטימיזציה שיטה זו עבור קו פעיל מאוד-1, ממוקם ב 22q 12.1, ובעבר הוכיחה את זה להיות רגיש מאוד בזיהוי הוספות תת שבטיים בסרטן המעי הגס14.
ההצלחה של LDI-PCR תלוי באיכות של דנ א גנומית. לכן, כללנו צעד נוסף בקרת איכות כדי להבטיח כי בתחילת הפרוטוקול, משקל מולקולרי גבוהה DNA הוא קיים (שלב 2.1.2). אנו ממליצים לאחסן DNA גנומית ב-20 ° c עבור אחסון לטווח ארוך, וכדי להכין את האליבטים כדי למנוע מחזורים של הקפאה והפשרה. באמצעות דנ א גנומית של דם או החולה בהתאמה לרקמות נורמלי מומלץ מאוד להבחין אם שורה 1 הרטרווזיציה זיהה הוא germline או אירוע סומאטיק. מאז לחתוך אתרים עבור אנזימים הגבלה הם סטוכסטי בגנום, ייתכן כי אתר מסוים הכניסה מסוימים דה נובו קו -1 עשוי לא לעגן כל האתרים לחתוך את האנזים ההגבלה לשמש בסביבתו. מכאן כדי להגדיל את הסבירות לזהות את רוב הוספות דה נובו LINE-1 ב-DNA הגידול, יותר מאשר אנזים הגבלה אחת יש להשתמש בתגובות נפרדות כדי ליצור ספריות שונות של תבנית DNA מעגלית. יתר על כן, אם התגית הייחודית של קו -1 של ריבית יש יותר מאשר PAS אחד, ולאחר מכן שימוש זוגות פריימר הסמוכים כל PAS משפר את הסיכויים לזהות הפרשות מקוצר בכבדות.
למרות שיטות אלגנטיות לזיהוי הגנום כולו של הוספות דה נובו קו 1 קיימים, הם יכולים להיות מכריע אם המטרה היא לחקור את היכולת הרטרוספיוזיציה של קו 1 מסוים בהקשר הסלולר הספציפי. למטרה זו, LDI-PCR יכול להיות גישה זולה ופשוטה אך איתנה כדי להמחיש את האירועים LINE-1 הרטרוציציציה. הגישה המכוונת המשמשת בשיטה זו דומה ל-TS-אטלס22; עם זאת, LDI-PCR מתחמק משימוש באמצעות מקשר והוא יכול להגביר את שני הצמתים של הכניסה של דה נובו קו 1 בו זמנית. מידע בנוגע הן 5 או 3 צמתים של הכניסה LINE-1, אתר היעד של אינטגרציה, הזנב polyA ושינויים באתר היעד, כולם הם הסימנים ההיכר של קו 1 הרטרושיציה, ניתן להשיג על ידי צימוד LDI-PCR עם מולקולה אחת טכנולוגיות לקריאה ארוכת טווח. קריאות ארוכות שנוצרות כך מכילות את רצף קו -1 שהוכנס, את התג הייחודי ואת רצפי היעד בקריאה אחת בודדת, המתקשים במיפוי קריאות קצרות באזור החוזר.
קיימות שתי מגבלות עיקריות המשתמשות ב-LDI-PCR לאיתור פעילות LINE-1. הראשון הוא הפנימי של ה-PCR: זה יכול רק להגביר באופן אמין שברים עד 10 kb בגודל. יש לשקול זאת בעת בחירה באנזים הגבלה, מאחר שהשבר המקורי לא יעלה על מגבלה זו. שנית, שיטה זו יכולה רק לזהות את אירועי הרטרוטרנספוזיציה הניוד של האזור השני של שלושה מאגפים באמצעות 3 התמרה. מכאן, הפעילות של אלה שורה 1 שאינם מציגים 3 התמרה המצב לא יזוהו באמצעות שיטה זו. בנוסף, למרות היותו מוגבר על ידי LDI-PCR, כמה אירועים שורה 1 הרטרוליציה כי (א) ליצור מטרה PCR בגודל דומה כמו מיקום “יליד” או הנחות אחרות או (ב) הם נדירים או תת שבטיים, לא ניתן לזהות על ידי agarose ג’ל אלקטרופורזה. כזה שורה 1 אירועים הרטרוטציה ניתן ללכוד על ידי רצף מוצר LDI-PCR באמצעות מולקולה בודדת לקריאה ברצף טכנולוגיות14.
זרימת העבודה המתוארת כאן יכולה להיות שונה בקלות כדי לזהות את הפעילות של “חם” LINE-1s על-ידי שימוש באנזים הגבלה מתאים על-ידי תכנון התחל ההופכי מיקוד קו 1s. בנוסף לזיהוי קו -1 בתיווך 3 התמרה, שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לזהות פחות השכיחות של קו -1 מתווך 5 התמרה23. שיטה דומה שימשו כדי לזהות את אתר האינטגרציה של כתבים LINE-1 בתוך תא מבוסס על24 ו הספק אתרי אינטגרציה בסרטן25. מלבד LINE-1 הוספות, שיטה זו יכולה גם להיות מנוצל כדי לזהות סטיות גנוסטיות אחרות, כגון הסדרים מחדש DNA, שבו מידע על האזור מועדים מראש שכבר קיים26.
The authors have nothing to disclose.
היינו רוצים להודות לכל העמיתים שלנו במאמר שבו שיטה זו תוארה לראשונה14, במיוחד טטיאנה Cajuso, Kimmo פיילין, אוטי Kilpivaara ו-Esa Pitkänen לדיונים יקרי ערך בעת פיתוח השיטה. L.K. ממומנת על ידי האקדמיה של פינלנד (להעניק מספרים 25996, 292789, 306026 ו 314394), קרן Juselius Sigrid, והאגודה הפינית לסרטן. לחץ דם הוא הנמען של אוניברסיטת הלסינקי הקרן מחקר האגודה שלנו, מענק האגודה לסרטן החברה הפינית, ומענק מחקר דוקטורט מאידה מונטיטין זאקטיסי. אנחנו גם מודים Teemu Masalin (אוניברסיטת הלסינקי) ו קול Shrestha מקבוצת המחקר של L.K. לסייע לנו עם הפקת וידאו.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |