Questo articolo descrive un semplice saggio basato su PCR per monitorare l’attività di un retrotrasposon LINE-1 attivo e per mappare retrotrasposizioni de novo in un determinato genoma. Utilizzando la linea cellulare MCF7, dimostri qui come questo metodo può essere applicato per rilevare l’attività di un LINE-1 situato a 22q12.1.
Gli elementi nucleari a lunga intersperatura 1 (LINE-1) sono l’unica famiglia di elementi genetici mobili nel genoma umano in grado di muoversi autonomamente. Lo fanno attraverso un processo chiamato retrotrasposizione in cui trascrivono per formare un mRNA intermedio che viene poi inserito nel genoma dalla trascrizione inversa. Nonostante siano silenziosi nelle cellule normali, i LINE-1 sono altamente attivi in diversi tumori epiteliali. De novo Gli inserimenti line-1 possono potenzialmente guidare la tumorigenesi, e quindi è importante studiare sistematicamente la retrotrasposizione LINE-1 nel cancro. Dei 150 LINE-1 retrotrassivi presenti nel genoma umano, solo una manciata di loci LINE-1, chiamati anche LINE-1 “caldi”, rappresentano la maggior parte dell’inserimento de novo LINE-1 in diversi tipi di cancro. Abbiamo sviluppato un semplice metodo basato sulla reazione a catena di polimerasi (PCR) per monitorare l’attività di retrotrasposizione di questi line-1 caldi. Questo metodo, basato sulla PCR inverso a lunga distanza (LDI)-PCR, sfrutta la trasduzione 3, un meccanismo mediante il quale un LINE-1 mobilita la sua regione non ripetitiva di fianco, che può essere successivamente utilizzato per identificare gli eventi di trasduzione di de novo LINE-1 3 derivanti da un particolare line-1 caldo.
I lunghi elementi nucleari intervallati (LINE-1) sono una famiglia di elementi genetici mobili chiamati retrotrasposoni che possono spostarsi in modo indipendente da un luogo all’altro tramite un meccanismo di copia e incolla chiamato retrotrasposizione. Nel corso del tempo evolutivo, il genoma umano ha accumulato più di 500.000 copie di ripetizioni LINE-11. Tuttavia, la maggior parte delle copie LINE-1 presenti nel genoma sono mutate e quindi non possono muoversi attraverso la retrotrasposizione; solo 150 copie hanno una copia intatta della sequenza di DNA necessaria per spostarsi2. Nelle normali cellule somatiche, la mobilità di questi LINE-1 è limitata da diversi fattori ospiti3. Queste restrizioni sono alleviate in diversi tumori epiteliali, causando LINE-1 essere derepressi e con conseguente molti inserimenti de novo nel genoma del tumore4. Alcuni di questi inserimenti de novo associati al tumore hanno dimostrato di causare mutagenesi inserimento nei geni, quindi guidando la progressione tumorale5,6. Pertanto, è importante essere in grado di mappare nuovi inserimenti nel genoma del tumore.
I metodi esistenti per rilevare gli inserimenti de novo LINE-1 utilizzano (1) l’approccio di sequenziamento dell’intero genoma4,7,8, in cui vengono utilizzati diversi algoritmi computazionali per trovare inserimenti de novo LINE-1 dai dati WGS, o (2) sequenziamento di nuova generazione che si rivolge alla fine di 3, potenzialmente attivi LINE-1s9,10,11,12,13. Tuttavia, trovare nuovi inserimenti tra diverse migliaia di copie quasi identiche con questi metodi è tutt’altro che banale, e la sfida è ulteriormente aggravata dall’eterogeneità tumorale e dalle alterazioni genomiche associate all’inserimento LINE-14.
Studi che utilizzano questi metodi esistenti hanno mostrato che solo pochi LINE-1 rappresentano la maggior parte degli inserimenti de novo LINE-1 osservati nei tumori7,8. Pertanto, per verificare se un particolare campione di tumore mostra o meno l’attività line-1, è sufficiente mappare gli eventi retrotrasposizione causati da questa manciata di loci LINE-1 altamente attivi. In questo articolo, descriviamo un semplice metodo a catena di reazione alla polimerasi (PCR)14 che può essere utilizzato per monitorare l’attività di un particolare locus LINE-1 nel primo intron del gene TTC28 a 22q12.1 che è altamente attivo nel cancro colorettale 7 (in questo stato , 8. Questo locus LINE-1 sarà indicato come TTC28-LINE-1 in tutto l’articolo. Questo saggio identifica in modo specifico gli eventi retrotrasposizione de novo LINE-1 che mobilitano la sequenza non ripetitiva sulla regione di fiancheggiamento 3 della sorgente LINE-1 da un meccanismo chiamato 3 – trasduzione15. 3 – la trasduzione si verifica a causa del debole segnale di poliadenilazione LINE-1 (PAS) che fa sì che il meccanismo trascrizionale la salti e termini invece la trascrizione al PAS più forte a valle, catturando così la sequenza non ripetitiva di fianco ( d’ora in poi indicato come il “tag unico”) che viene poi inserito nella posizione di destinazione insieme alla sequenza LINE-1. Philippe et al.16 recentemente ha dimostrato che diversi tipi di cellule possono esprimere diversi loci LINE-1. Alla luce di questa scoperta, questo metodo può essere applicato per monitorare l’attività del LINE-1 più altamente espresso che mobilitano il loro tag unico nel tipo di cancro di interesse.
Il primo passo in LDI-PCR è la digestione del DNA genomico con un enzima di restrizione che genera un frammento di restrizione contenente il LINE-1 che viene analisi (qui, TTC28-LINE-1) e il suo tag unico (Figura 1). Il DNA digerito viene quindi circolare con l’auto-legamento e la PCR amplificata utilizzando primer inversi situati all’interno del tag unico. In questo modo, la sorgente a tutta lunghezza LINE-1 nella sua posizione “nativa” è sempre amplificata e accanto ad essa, gli inserimenti LINE-1 della prostesa in diversi loci di destinazione contenenti il tag unico saranno amplificati (Figura1), segnalando così così la segnalazione l’attività di retrotransposition del LINE-1 in questione.
Qui descriviamo un metodo che può essere utilizzato per identificare gli inserimenti de novo LINE-1 derivanti da qualsiasi LINE-1 attivo di interesse. Abbiamo ottimizzato questo metodo per un LINE-1 altamente attivo, situato a 22q12.1, e in precedenza dimostrato di essere altamente sensibile nel rilevamento di inserimenti sotto-clonali nel cancro colorettale14.
Il successo di LDI-PCR dipende dalla qualità del DNA genomico. Pertanto, abbiamo incluso un ulteriore passaggio di controllo della qualità per garantire che all’inizio del protocollo sia presente dna ad alto peso molecolare (passaggio 2.1.2). Si consiglia di conservare il DNA genomico a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine e di preparare l’aliquota al fine di evitare cicli di congelamento e scongelamento. L’uso del DNA genomico proveniente dal sangue o dal tessuto normale abbinato al paziente è altamente raccomandato per distinguere se la retrotrasposizione LINE-1 rilevata è una linea germinale o un evento somatico. Poiché i siti tagliati per gli enzimi di restrizione sono stocastici nel genoma, è possibile che un particolare sito di inserimento de novo LINE-1 non possa ospitare siti tagliati per l’enzima di restrizione utilizzato nelle sue vicinanze. Quindi, per aumentare la probabilità di rilevare la maggior parte degli inserimenti de novo LINE-1 nel DNA tumorale, più di un enzima di restrizione dovrebbe essere utilizzato in reazioni separate per generare diverse librerie di modello di DNA circolare. Inoltre, se il tag unico del LINE-1 di interesse ha più di un PAS, l’utilizzo di coppie di primer adiacenti a ogni PAS migliora le possibilità di rilevare trasduzioni fortemente troncate.
Sebbene esistano metodi eleganti per il rilevamento a livello di genoma degli inserimenti di de novo LINE-1, possono essere schiaccianti se l’obiettivo è quello di sondare la competenza retrotrasposizione di un particolare LINE-1 in uno specifico contesto cellulare. A questo scopo, LDI-PCR può essere un approccio economico e semplice ma robusto per visualizzare gli eventi retrotrasposizione LINE-1. L’approccio di targeting utilizzato in questo metodo è simile a TS-ATLAS22; tuttavia, LDI-PCR evita di utilizzare oligonucleotidi del linker e può amplificare contemporaneamente sia le giunzioni a 5 e 3 giunzioni di inserimento de novo LINE-1. Le informazioni relative sia alle giunzioni a 5 e 3 giunzioni dell’inserimento LINE-1, al sito di destinazione dell’integrazione, alla coda poliA e alle modifiche del sito bersaglio, tutte caratteristiche della retrotrasposizione LINE-1, possono essere ottenute accolando LDI-PCR a una singola molecola tecnologie di sequenziamento a lunga lettura. Le letture lunghe così generate contengono la sequenza LINE-1 inserita, il suo tag unico e le sequenze di destinazione in una sola lettura, eludendo le difficoltà di mappatura delle letture brevi nella regione ripetitiva.
L’utilizzo di LDI-PCR per il rilevamento dell’attività line-1 è costituito da due limitazioni principali. Il primo è inerente alla PCR: può amplificare solo in modo affidabile frammenti fino a 10 kb di dimensioni. Questo dovrebbe essere considerato durante la selezione di enzimi di restrizione, come il frammento nativo non deve superare questo limite. In secondo luogo, questo metodo è in grado di rilevare solo gli eventi retrotrasposizione che mobilitano la regione di fiancheggiamento di LINE-1 di 3 di 3 di 3 traslazioni. Quindi, l’attività di quei LINE-1 che non presentano 3 – trasduzione non sarà rilevata utilizzando questo metodo. Inoltre, nonostante siano stati amplificati da LDI-PCR, alcuni eventi retrotrasposizione LINE-1 che (a) generano un bersaglio PCR di dimensioni simili a quelle della posizione “nativa” o di altre retrotrasposizioni o (b) sono rare o subclonali, potrebbero non essere rilevati da gel agarose Elettroforesi. Tali eventi di retrotrasposizione LINE-1 possono essere catturati sequenziando il prodotto LDI-PCR utilizzando tecnologie di sequenziamento a lunga lettura a singola molecola14.
Il flusso di lavoro qui descritto può essere facilmente modificato per rilevare l’attività di altri LINE-1 “caldi” utilizzando un enzima di restrizione adatto e progettando primer inversi mirati a questi LINE-1. Oltre al rilevamento della trasduzione MEDIAta da LINE-1 3′, questo metodo può essere adattatoper rilevare le trasduzioni line-1 mediate meno frequenti 5. Metodo simile sono stati utilizzati per identificare il sito di integrazione dei reporter LINE-1 nei saggi basati sulle cellule24 e nei siti di integrazione provirale nel cancro25. Oltre agli inserimenti di LINE-1, questo metodo può essere utilizzato anche per rilevare altre aberrazioni genomiche, come il riarrangiamento del DNA, dove le informazioni riguardanti la regione soggetta a riarrangiamento pre-esistono26.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare tutti i nostri co-autori nell’articolo in cui questo metodo è stato descritto per la prima volta14, in particolare Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara e Esa Pitkànen per le discussioni preziose durante lo sviluppo del metodo. L.K. è finanziato dall’Accademia di Finlandia (numeri di sovvenzione 25996, 292789, 306026 e 314394), dalla Fondazione Sigrid Juselius e dalla Società finlandese per il cancro. B.P. è stato insignito della borsa di studio PhD dell’Università di Helsinki Research Foundation, di una borsa di studio della Società finlandese per il cancro e di una borsa di ricerca di dottorato presso Ida Montinin S. Ringraziamo anche Teemu Masalin (Università di Helsinki) e Kul Shrestha del gruppo di ricerca di L.K. per averci aiutato nella produzione video.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |