この記事では、活性LINE-1レトロトランスポゾンの活性を監視し、所定のゲノム内のデノボレトロトランスポジションをマッピングするための簡単なPCRベースのアッセイについて概説する。MCF7細胞株を用いて、この方法を22q12.1にあるLINE-1の活動を検出するためにどのように適用できるかを示す。
長く散在する核要素1(LINE-1)は、自律的に移動できるヒトゲノムの移動遺伝元素の唯一のファミリーです。彼らは逆転写と呼ばれるプロセスによって行われ、その結果、逆転転写によってゲノムに挿入されるmRNA中間体を形成するために転写する。正常な細胞では沈黙しているにもかかわらず、LINE-1は異なる上皮腫瘍において非常に活性である。デ・ノボLINE-1挿入は腫瘍形成を引き起こす可能性があるため、がんにおけるLINE-1レトロトランスポジションを体系的に研究することが重要です。ヒトゲノムに存在する約150のレトロトランスポジション能力を持つLINE-1のうち、”ホット”LINE-1とも呼ばれるLINE-1遺伝子座はほんの一握りで、異なるがんタイプにおけるデノボLINE-1挿入の大部分を占めています。これらのホットLINE-1のレトロトランスポジション活性をモニタリングする簡易ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの方法を開発した。この方法は、長距離逆(LDI)-PCRに基づいて、LINE-1が横方向の非反復領域を動員するメカニズムである3~3のトランスダクションを利用し、その後、デノボLINE-1 3 3のトランスダクションイベントを識別するために使用することができます。特定のホットLINE-1に由来します。
デノボLINE-1挿入を検出する既存の方法は、(1)全ゲノムシーケンシングアプローチ4、7、8、異なる計算アルゴリズムを使用してde novo LINE-1挿入を見つけるために使用されますWGSデータ、または(2)若い、潜在的にアクティブなLINE-1s 9、10、11、12、13の3~の終わりをターゲットとする次世代シーケンシング。しかし、これらの方法を用いた数千近い同一コピーの中から新しい挿入を見つけることは些細なものであり、LINE-1挿入4に伴う腫瘍の不均一性とゲノム変化によってさらに悪化する。
これらの既存の方法を用いて行った研究では、腫瘍7、8で観察されたデノボLINE-1挿入の大部分を占めるLINE-1がほんのわずかであることを示した。したがって、特定の腫瘍サンプルがLINE-1活性を示すかどうかを答えるために、この一握りの非常に活発なLINE-1遺伝子座によって引き起こされるレトロトランスポジションイベントをマッピングするだけで十分である。本稿では、大腸癌で高活性である22q12.1でTTC28遺伝子の第1イントロンにおける特定のLINE-1遺伝子座の活性を監視するために使用できる単純なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの方法14について説明する。7,8.このLINE-1遺伝子座は、記事全体を通じてTTC28-LINE-1と呼ばれます。このアッセイは、ソースLINE-1の3~横面領域に非反復配列を動員するデノボLINE-1レトロトランスポジションイベントを、3~トランスダクション15と呼ばれるメカニズムによって具体的に特定する。3 3 3 3 0/4 トランスダクションは、転写機械がそれをスキップし、代わりにより強いPAS下流で転写を終了させる弱いLINE-1ポリアデニル化信号(PAS)のために起こり、したがって、横向きの非反復配列((その後、LINE-1シーケンスと並んでターゲットの位置に挿入される「ユニークタグ」と呼ばれます。Philippe et al.16は最近、異なる細胞型が異なる LINE-1 遺伝子座を発現できることを示した。この知見を踏まえ、がん型の独自のタグを動員する最も高い表現力を持つLINE-1の活動をモニタリングするために、この手法を適用することができる。
LDI-PCRの最初のステップは、アッセイされるLINE-1を含む制限断片を生成する制限酵素を有するゲノムDNAの消化であり(ここでは、TTC28-LINE-1)とそのユニークなタグ(図1)。消化されたDNAは、自己ライゲーションによって円形化され、一意のタグ内にある逆プライマーを用いてPCR増幅される。そうすることで、「ネイティブ」の位置にあるフルレングスソースLINE-1が常に増幅され、それと一緒に、一意のタグを含む異なるターゲット遺伝子座での子孫LINE-1挿入も増幅されます(図1)。問題のLINE-1の遡及活動。
ここでは、関心のある任意のアクティブなLINE-1に起因するデノボLINE-1挿入を識別するために使用できる方法を説明します。我々は、22q12.1に位置する非常に活性なLINE-1のためにこの方法を最適化し、以前に大腸癌14におけるサブクローン挿入を検出する上で高感度であることを実証した。
LDI-PCRの成功はゲノムDNAの質に依存する。したがって、プロトコルの開始時に高分子量DNAが存在することを保証するための追加の品質管理ステップが含まれています(ステップ2.1.2)。長期保存のために-20°CでゲノムDNAを保存し、凍結解凍のサイクルを避けるためにアリコートを調製することをお勧めします。血液または患者と一致した正常組織からのゲノムDNAを使用して、検出されたLINE-1レトロトランスポジションが生殖細胞系または体細胞イベントであるかどうかを区別することを強くお勧めします。制限酵素の切断部位はゲノム中で確率的であるため、特定のde novo LINE-1挿入部位は、その近傍で使用されている制限酵素の切断部位を収容しない可能性があります。したがって、腫瘍DNA中のデノボLINE-1挿入物の大部分を検出する可能性を高めるために、複数の制限酵素を別々の反応で使用して、円形DNAテンプレートの異なるライブラリーを生成する必要があります。さらに、対象のLINE-1のユニークなタグが複数のPASを持っている場合、各PASに隣接するプライマーペアを使用すると、重く切り捨てられたトランスダクションを検出する可能性が向上します。
デノボLINE-1挿入物のゲノム全体検出のためのエレガントな方法は存在するが、特定の細胞コンテキストにおける特定のLINE-1のレトロトランスポジション能力をプローブすることを目的とすれば、それらは圧倒的である可能性がある。このため、LDI-PCRは、LINE-1レトロトランスポジションイベントを可視化するための安価でシンプルで堅牢なアプローチです。この方法で使用されるターゲティングアプローチは、TS-ATLAS22に似ています。しかし、LDI-PCRはリンカーオリゴヌクレオチドの使用を回避し、デノボLINE-1挿入の5~3~のジャンクションを同時に増幅することができます。LINE-1挿入の5~3/4ジャンクション、統合の対象部位、ポリAテールおよびターゲットサイトの変更に関する情報は、いずれもLINE-1レトロトランスポジションの特徴であり、LDI-PCRを単一分子と結合することで得ることができる。長読みシーケンシング技術。このように生成された長い読み取りには、挿入されたLINE-1シーケンス、その一意のタグ、およびターゲットシーケンスが1回の読み取りで含まれ、繰り返し領域での短い読み取りのマッピングの難しさを回避します。
LINE-1のアクティビティを検出するためにLDI-PCRを使用することには、2つの大きな制限があります。1 つ目は PCR に固有のものです: 最大 10 kb のフラグメントを確実に増幅できます。ネイティブフラグメントがこの制限を超えてはならないため、制限酵素を選択する際に考慮する必要があります。第二に、この方法は、LINE-1の33の側面領域を3/4のトランスダクションによって動員するレトロトランスポジションイベントのみを検出することができます。したがって、この方法では、3~3分の1のトランスダクションを示さないLINE-1の活動は検出されません。さらに、LDI-PCRによって増幅されているにもかかわらず、(a)「ネイティブ」位置または他のレトロトランスポジションと同様のサイズのPCRターゲットを生成する一部のLINE-1レトロトランスポジションイベント、または(b)まれまたはサブクローナルであり、アガロースゲルによって検出されない場合があります。電気 泳 動。このようなLINE-1レトロトランスポジションイベントは、単分子長読シーケンシング技術14を用いてLDI-PCR産物をシーケンシングすることによって捕捉することができる。
ここで説明するワークフローは、適切な制限酵素を使用し、これらのLINE-1をターゲットとする逆プライマーを設計することにより、他の「ホット」LINE-1の活性を検出するために簡単に変更することができます。この方法は、LINE-1媒介3~3/4トランスダクションの検出に加えて、より頻度の低いLINE-1媒介5~3/4トランスダクション23を検出するように適合させることができる。同様の方法は、細胞ベースのアッセイ24および癌25におけるプロウイルス統合部位におけるLINE-1レポーターの統合部位を同定するために用いられている。この方法は、LINE-1挿入に加えて、DNA再配置などの他のゲノム収差を検出するためにも利用することができ、再配置が起こりやすい領域に関する情報が存在する26。
The authors have nothing to disclose.
この方法が最初に説明された記事の共同執筆者全員、特にタチアナ・カジュソ、キムモ・パリン、ウティ・キルピヴァーラ、エサ・ピトケネンの共著者の皆さんに感謝します。L.K.は、フィンランドアカデミー(助成番号25996、292789、306026および314394)、シグリッド・ジュセリウス財団、フィンランド癌協会によって資金提供されています。B.P.は、ヘルシンキ大学研究財団博士課程、フィンランド癌学会論文交付金、およびイダ・モンティニン・セーティオ博士研究助成金を受けています。また、L.K.の研究グループのテム・マサリン(ヘルシンキ大学)とクル・シュレスタ氏に、映像制作を支援してくださったことに感謝します。
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |