이 문서는 활성 LINE-1 레트로트랜스포종의 활성을 모니터링하고 주어진 게놈에서 드 노보 역변도를 매핑하는 간단한 PCR 기반 분석방법을 간략하게 설명합니다. MCF7 세포주를 사용하여, 우리는 이 방법을 22q12.1에 위치한 LINE-1의 활성을 검출하기 위해 어떻게 적용될 수 있는지를 본원에서 입증한다.
긴 산재 핵 원소 1 (LINE-1s)는 자율적으로 이동할 수있는 인간 게놈의 모바일 유전 요소의 유일한 가족입니다. 그(것)들은 그 때 역 전사에 의해 게놈으로 그 때 삽입되는 mRNA 중간체를 형성하기 위하여 전사하는 것을 특징으로 하는 retrotransposition에게 불린 프로세스에 의해 이렇게 합니다. 정상 세포에서 침묵에도 불구하고 LINE-1s는 상피 종양에서 매우 활동적입니다. 드 노보 LINE-1 삽입은 잠재적으로 종양 발생을 유발할 수 있으므로 암에서 LINE-1 역변증을 체계적으로 연구하는 것이 중요합니다. 인간 게놈에 존재하는 ~150개의 역류 유능한 LINE-1s 중, “핫” LINE-1이라고도 불리는 소수의 LINE-1 좌위만이 다른 암 유형에서 드노보 LINE-1 삽입의 대부분을 차지합니다. 우리는 이러한 뜨거운 LINE-1s의 역변도 활성을 모니터링하는 간단한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 방법을 개발했습니다. 장거리 역(LDI)-PCR을 기반으로 하는 이 방법은 LINE-1이 측면 비반복 영역을 동원하여 이후에 de novo LINE-1 3′ transduction 이벤트를 식별하는 데 사용할 수 있는 메커니즘인 3′ 변환을 활용합니다. 특정 핫 LINE-1에서 유래.
긴 산재 핵 요소 (LINE-1s)는 독립적으로 레트로 트랜스 포지션이라는 복사 및 붙여 넣기 메커니즘을 통해 한 장소에서 다른 곳으로 이동할 수있는 retrotransposons라는 모바일 유전 요소의 가족입니다. 진화적 시간이 지남에 따라 인간 게놈은 LINE-1 반복1의500,000 개 이상의 사본을 축적했습니다. 그러나, 게놈에 존재하는 LINE-1 사본의 대부분은 돌연변이되고 그러므로 retrotransposition를 통해 이동할 수 없습니다; 만 ~ 150 사본은그들이2를 이동하는 데 필요한 DNA 서열의 그대로 사본을 가지고 . 정상 체세포에서, 이들 LINE-1s의 이동성은 상이한 숙주 인자3에의해 제한된다. 이러한 제한은 상피 종양에서 완화되어 LINE-1s가 억압되고 종양 게놈 4에 많은 de novo 삽입을 초래합니다. 이들 종양 관련 드노보 삽입중 일부는 유전자에 삽입 돌연변이발생을 유발하는 것으로 나타났으며, 따라서 종양 진행을 5,6으로유도한다. 따라서 종양 게놈에 새로운 삽입을 매핑할 수 있어야 합니다.
de novo LINE-1 삽입을 검출하는 기존 방법은 (1) 전체게놈 시퀀싱 접근 법 4,7,8,여기서 다른 계산 알고리즘이 de novo LINE-1 삽입을 찾는 데 사용됩니다. WGS 데이터에서, 또는 (2) 젊고 잠재적으로 활동적인 LINE-1s9,10,11,12,13의3′ 끝을 대상으로 하는 차세대 시퀀싱. 그러나, 이 방법을 가진 수천 거의 동일 사본 중 새로운 삽입을 찾아내는 것은 사소한에서 멀리, 및 도전은 LINE-1 삽입4와 관련되었던종양 이질성 및 게놈 변경에 의해 더욱 가중됩니다.
이러한 기존 방법을 이용한 연구는 단지 몇 개의 LINE-1이 종양7,8에서관찰된 데노보 LINE-1 삽입의 대부분을 차지한다는 것을 보여주었다. 따라서, 특정 종양 샘플이 LINE-1 활성을 표시하는지 여부에 대한 대답을 하기 위해, 이러한 고활성 LINE-1 좌위소수에 의한 역변좌 이벤트를 매핑하는 것으로 충분하다. 본 기사에서는, 대장암에서 매우 활동적인 22q12.1에서 TTC28 유전자의 제1인트론에서 특정 LINE-1 궤적의 활성을 모니터링하는데 사용될 수 있는 간단한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 방법14를 설명합니다. 7명 , 8. 이 LINE-1 궤적은 기사 전반에 걸쳐 TTC28-LINE-1로 지칭됩니다. 이 분석은 특히 3′ transduction15라는메커니즘에 의해 소스 LINE-1의 3′ 측면 영역에서 비반복 시퀀스를 동원하는 de novo LINE-1 역류 이벤트를 식별합니다. 3′ 전이는 약한 LINE-1 폴리아데닐화 신호(PAS)로 인해 발생하며, 이로 인해 전사 기계가 이를 건너뛰고 대신 더 강한 PAS 다운스트림에서 전사를 종료하여 측면 비반복 시퀀스를 캡처합니다. 이제부터는 LINE-1 시퀀스와 함께 대상 위치에 삽입되는 “고유 태그”라고 합니다. Philippe 등 16은 최근 상이한 세포 유형이 상이한 LINE-1 로시를 발현할 수 있음을 보여주었다. 이러한 발견에 비추어, 이 방법은 관심있는 암 유형에서 그들의 독특한 태그를 동원하는 가장 고도로 발현된 LINE-1의 활성을 모니터링하기 위해 적용될 수 있다.
LDI-PCR의 제1 단계는 분석되는 LINE-1을 포함하는 제한 단편을 생성하는 제한 효소를 가진 게놈 DNA의 소화(여기, TTC28-LINE-1) 및 그의 독특한 태그(도 1)이다. 소화된 DNA는 독특한 태그 내에 위치한 역 프라이머를 사용하여 자기 결찰 및 PCR 증폭에 의해 원형화됩니다. 이렇게 함으로써, 그것의 “네이티브” 위치에서 전체 길이 소스 LINE-1은 항상 증폭되고 그와 함께, 독특한 태그를 포함하는 다른 표적 좌시에 자손 LINE-1 삽입은 또한 증폭될 것입니다 (그림1),따라서 보고 LINE-1의 역변 활동.
여기서는 관심 있는 활성 LINE-1에서 비롯된 de novo LINE-1 삽입을 식별하는 데 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 우리는 22q12.1에 위치한 고활성 LINE-1에 대해 이 방법을 최적화했으며, 이전에 는 대장암14에서서브 클론 삽입을 검출하는 데 매우 민감하다는 것을 입증했습니다.
LDI-PCR의 성공은 게놈 DNA의 질에 달려 있습니다. 따라서, 프로토콜의 시작 시, 고분자 DNA가 존재하도록 보장하기 위한 추가적인 품질 관리 단계를 포함하였다(단계 2.1.2). 장기 보관을 위해 유전체 DNA를 -20°C에 저장하고 동결 및 해동 주기를 피하기 위해 알리쿼트(aliquots)를 준비하는 것이 좋습니다. 혈액 또는 환자 일치 정상 조직에서 게놈 DNA를 사용하여 검출 된 LINE-1 역류가 생식선 인지 체세포 이벤트인지 여부를 구별하는 것이 좋습니다. 제한 효소에 대한 절단 부위는 게놈에서 스토크되기 때문에, 특정 드노보 LINE-1 삽입 부위는 그 부근에서 사용되는 제한 효소에 대한 절단 부위를 수용하지 않을 수 있다. 따라서 종양 DNA에 있는 de novo LINE-1 삽입의 대다수를 검출의 가능성을 증가시키기 위하여는, 하나 이상의 제한 효소는 원형 DNA 템플릿의 다른 라이브러리를 생성하기 위하여 별도의 반응에서 이용되어야 합니다. 또한 관심 있는 LINE-1의 고유한 태그에 둘 이상의 PAS가 있는 경우 각 PAS에 인접한 프라이머 쌍을 사용하면 심하게 잘린 변환을 감지할 가능성이 높아진다.
de novo LINE-1 삽입의 게놈 전체 검출을 위한 우아한 방법이 존재하지만, 특정 세포 맥락에서 특정 LINE-1의 역변술 능력을 조사하는 것이 목표라면 압도적일 수 있습니다. 이를 위해 LDI-PCR은 LINE-1 역변좌 이벤트를 시각화하는 저렴하고 간단하면서도 강력한 접근 방식이 될 수 있습니다. 이 메서드에 사용되는 타겟팅 방법은 TS-ATLAS22와유사합니다. 그러나 LDI-PCR은 링커 올리고뉴클레오티드를 사용하지 않으며 5’와 3′ 드노보 LINE-1 삽입의 접합부를 동시에 증폭시킬 수 있습니다. LINE-1 삽입의 5단 및 3개의 접합부, 통합, 폴리아 테일 및 표적 부위 수정의 대상 부위에 대한 정보는 모두 LINE-1 역류의 특징이며, LDI-PCR을 단일 분자와 결합하여 얻을 수 있습니다. 긴 시퀀싱 기술. 이렇게 생성된 긴 읽기에는 삽입된 LINE-1 시퀀스, 고유한 태그 및 대상 시퀀스가 하나의 읽기로 포함되며, 반복 영역에서 짧은 읽기매핑의 어려움을 우회합니다.
LINE-1 활성을 감지하기 위해 LDI-PCR을 사용하는 데는 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 첫 번째는 PCR에 내재되어 있습니다: 최대 10kb 크기의 조각만 안정적으로 증폭할 수 있습니다. 이것은 네이티브 단편이 이 한계를 초과해서는 안 되기 때문에 제한 효소(들)를 선택하는 동안 고려되어야 합니다. 둘째, 이 방법은 LINE-1의 3′ 측면 영역을 3′ 변환으로 동원하는 역변처리 이벤트만 감지할 수 있습니다. 따라서 3′ 변환을 나타내지 않는 LINE-1의 활동은 이 방법을 사용하여 감지되지 않습니다. 또한, LDI-PCR에 의해 증폭되음에도 불구하고, (a) “네이티브” 위치 또는 다른 후퇴와 유사한 크기의 PCR 표적을 생성하는 일부 LINE-1 역류 이벤트는 희귀하거나 서브클로날링, 아가로즈 겔에 의해 검출되지 않을 수 있다. 전기. 이러한 LINE-1 역변기 이벤트는 단일 분자를 사용하여 LDI-PCR 제품을 시퀀싱하여 포획할수 있다 14.
여기서 설명된 워크플로우는 적절한 제한 효소를 사용하고 이러한 LINE-1을 대상으로 하는 역 프라이머를 설계하여 다른 “핫” LINE-1의 활성을 검출하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. LINE-1 매개 3′ 변환의 검출 이외에, 이 방법은 덜 빈번한 LINE-1 매개 5′ 환원23을검출하도록 조정될 수 있다. 유사한 방법은 세포기반 검문24및 암(25)에서 의한 프로바이러스 통합 부위에서LINE-1 리포터의 통합 부위를 식별하기 위해 사용되어 왔다. LINE-1 삽입 외에도, 이 방법은 또한 재배열되기 쉬운 영역(26)에 관한 정보가 존재하는 DNA 재배열과 같은 다른게놈 수차를 검출하는데 활용될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 방법이 처음 설명 된 문서에서 우리의 모든 공동 저자에게 감사드립니다14,특히 타티아나 카주소, 김모 팔린, Outi 킬피바라와 에사 Pitkänen 방법을 개발하는 동안 가치있는 토론을 위해. L.K.는 핀란드 아카데미(교부금 번호 25996, 292789, 306026 및 314394), 시그리드 주셀리우스 재단, 핀란드 암 학회가 후원합니다. B.P.는 헬싱키 연구 재단 박사 과정 학생, 핀란드 암 학회 논문 교부금, 그리고 이다 몬틴 Säätiö의 박사 연구 보조금의 수혜자입니다. 또한 비디오 제작을 지원해 준 La.K.의 연구 그룹에서 티무 마살린(헬싱키 대학교)과 쿨 슈레스타(Kul Shrestha)에게 감사드립니다.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |