Bu makalede, aktif bir hat-1 retrotransposon aktivitesini izlemek ve belirli bir genom de Novo retrotranspositions eşlemek için basit bir PCR tabanlı tahlil özetlenmektedir. MCF7 hücre hattını kullanarak, burada bu yöntemin 22q 12.1 ‘de bulunan bir satır 1 ‘ in aktivitesini algılamak için nasıl uygulanacağını gösteriyoruz.
Uzun serpiştirilmiş nükleer elemanları 1 (hat-1s) otonom hareket edebilir insan genomu mobil genetik öğelerin tek ailesidir. Onlar bu yüzden bir süreç olarak adlandırılan retrotransposition onlar sonra sonuç olarak ters transkripsiyon tarafından genom içine yerleştirilen bir mRNA ara oluşturmak için nasıl. Normal hücrelerde sessiz olmasına rağmen, LINE-1s farklı epitelyal tümörlerde son derece aktif. De Novo LINE-1 eklemeler potansiyel olarak tumorigenesis sürücü ve bu nedenle sistemik hat-1 retrotranspozis kanserde çalışma önemlidir. Out of ~ 150 retrotransposition-yetkili hat-1s insan genomu mevcut, LINE sadece bir avuç-1 loci, aynı zamanda “sıcak” LINE-1s olarak da adlandırılır, farklı kanser türlerinde de Novo Line-1 ekleme çoğunluğu için hesap. Biz basit bir polimeraz zincir reaksiyonu geliştirdik (PCR)-bu sıcak hat-1s retrotransposition etkinliğini izlemek için tabanlı yöntem. Uzun mesafe ters (LDı)-PCR dayalı bu yöntem, 3 ‘ dönüştürücü, bir hat-1 tarafından daha sonra da Novo LINE-1 3 ́ dönüştürücü olayları tanımlamak için kullanılabilir kendi çevreleme olmayan bölge, harekete geçen bir mekanizma yararlanır belirli bir sıcak hat-1 kaynaklanan.
Uzun serpiştirilmiş nükleer elemanları (LINE-1s), geriye dönük olarak adlandırılan bir kopya ve yapıştırma mekanizması ile bağımsız olarak bir yerden diğerine hareket edebilir retrotranspozonları denilen mobil genetik elemanlar bir ailelerdir. Evrimsel zaman içinde, insan genomu satır-1 tekrarlar1‘ den fazla 500.000 kopyalarını birikmiş. Ancak, genomda bulunan satır-1 kopyalarının çoğu mutasyona uğramış ve bu nedenle retrotranspozite yoluyla hareket edemez; sadece ~ 150 kopya onlar2taşımak IÇIN gerekli DNA dizisi bozulmamış kopyası var. Normal somatik hücrelerde, bu LINE-1s mobilitesini farklı konak faktörleri3ile kısıtlanır. Bu kısıtlamalar farklı epitelyal tümörlerde rahatlıyor, LINE-1s ‘ l e neden derepressed ve tümörün genomu4‘ te birçok de Novo insersiyonları ortaya çıkacak. Bu tümör ilişkili de Novo eklemeler bazıları genlerde insersiyon mutagenez neden gösterildi, dolayısıyla tümör ilerlemesi sürüş5,6. Bu nedenle, tümör genomunda yeni eklemeler eşlemesini muktedir önemlidir.
De Novo Line-1 eklemeler algılamak için mevcut Yöntemler (1) tüm genom sıralama yaklaşımı4,7,8, burada farklı Hesaplamalı algoritmalar de Novo Line-1 eklemeler bulmak için kullanılır WGS verilerinden veya (2) yeni nesil sıralama, Genç, potansiyel olarak aktif hat-1s9,10,11,12,13‘ ün 3 ‘ ü sonuna kadar hedefler. Ancak, bu yöntemlerle birkaç bin yakın özdeş kopya arasında roman eklemeler bulmak önemsiz uzak, ve zorluk daha fazla tümör heterojenite ve hat-1 ekleme4ile ilişkili genomik değişiklikler tarafından ağırlanmış olduğunu.
Bu mevcut yöntemleri kullanarak çalışmalar gösterdi ki sadece birkaç satır-1s büyük çoğunluğu için hesap de Novo LINE-1 eklemleri tümörlerde gözlenen7,8. Bu nedenle, belirli bir tümör örneği ÇIZGI-1 aktivite görüntüler olup olmadığını yanıtlamak için, bu son derece aktif LINE-1 loci bu avuç neden retrotransposition olayları eşlemek için yeterlidir. Bu makalede, biz basit bir polimeraz zincir reaksiyonu açıklamak (PCR)-tabanlı Yöntem14 belırlı bir hat aktivitesini izlemek için kullanılabilir-1 Locus TTC28 geni ilk intron içinde 22q 12.1 son derece Kolorektal kanserde aktif 7 , 8. bu hat-1 Locus olarak adlandırılır TTC28-LINE-1 Makale boyunca. Bu tahlil özellikle de Novo Line-1 retrotransposition olayları, 3 ‘ dönüştürücü15denilen bir mekanizma tarafından kaynak satır-1 ‘ in 3 ‘ yan bölgesinde tekrarsız sırasını seferber tanımlar. 3 ‘ dönüştürücü, zayıf hat-1 polyadenilasyon sinyali (pas) nedeniyle gerçekleşir ve bunun yerine, transkripsiyon makinelerinin onu atlamasına ve daha güçlü pas alt kısmında transkripsiyon sonlandırılmasına neden olmaktadır ( Bundan sonra satır-1 dizisinin yanında hedef konuma eklenen “benzersiz etiket” olarak adlandırılır). Philippe ve ark.16 son zamanlarda farklı hücre TÜRLERI farklı LINE-1 loci ifade edebilir gösterdi. Bu bulgu ışığında, bu yöntem en çok ifade edilen satır-1 etkinliği izlemek için uygulanabilir, ilgi kanser türü kendi benzersiz etiket seferber.
LDı-PCR ‘ d a ilk adım, satır-1 ‘ i (burada, TTC28-Line-1) ve benzersiz etiketini (Şekil 1) içeren bir kısıtlama parçası üreten bir kısıtlama enzimiyle genomik DNA ‘nın sindirimi. Sindirilmiş DNA daha sonra Self-ligasyon ve PCR benzersiz etiketi içinde bulunan ters astar kullanılarak amplifikatörlü tarafından circularized. Bunu yaparak, tam uzunluklu kaynak hattı-1 kendi “yerel” konumda her zaman amplifikatörleşmiş ve yanında, yavru ÇIZGI-1 eklemeler farklı hedef loci benzersiz etiketi içeren de amplifikatörleşmiş olacak (Şekil 1), böylece raporlama söz konusu satır-1 retrotransposition aktivitesi.
Burada de Novo Line-1 eklemeleri herhangi BIR etkin hat-1 ilgi kaynaklanan tanımlamak için kullanılabilecek bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi, 22q 12.1 ‘de bulunan son derece aktif bir hat-1 için optimize ettik ve daha önce kolorektal kanser14‘ te alt klonal eklemeler tespit etmek için son derece hassas olduğunu göstermiştir.
LDı-PCR başarısı genomik DNA ‘nın kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, protokolün başlangıcında, yüksek moleküler ağırlık DNA ‘Sı mevcut (adım 2.1.2) olduğundan emin olmak için ek bir kalite kontrol adımı dahil ettik. Uzun süreli depolama için genomik DNA ‘yı-20 °c ‘ de saklamanızı ve donma ve çözme döngülerini önlemek için plakaya hazırlamak öneririz. Kan veya hasta uyumlu normal dokudan genomik DNA ‘Yı kullanarak, hat-1 retrotranspozin algılanıp bir germline veya somatik bir olay olup olmadığını ayırt etmek çok tavsiye edilir. Sınırlama enzimleri için kesme siteleri genomda Stokastik olduğundan, belirli bir de Novo LINE-1 ekleme sitesi çevresinde kullanılan kısıtlama enzimi için herhangi bir kesim siteleri liman olmayabilir mümkündür. Bu nedenle, tümör DNA ‘sında de Novo LINE-1 eklemeler çoğunluğu tespit olasılığını artırmak için, birden fazla kısıtlama ENZIM dairesel DNA şablonu farklı kütüphaneler oluşturmak için ayrı reaksiyonlar kullanılmalıdır. Ayrıca, Eğer LINE-1 ilgi benzersiz etiket birden fazla PAS varsa, daha sonra her PAS bitişik primer çiftleri kullanarak ağır kesilmiş transssiyonları tespit şansını geliştirir.
De Novo Line-1 eklemeleri genom çapında tespiti için zarif yöntemler var olsa da, amaç belirli bir hücre bağlamında belırlı bir hat-1 retrotransposition yetkinlik prob ise, onlar ezici olabilir. Bu amaçla, LDı-PCR LINE-1 retrotransposition olaylarını görselleştirmek için ucuz ve basit ama sağlam bir yaklaşım olabilir. Bu yöntemde kullanılan hedefleme yaklaşımı TS-ATLAS22‘ ye benzer; Ancak LDı-PCR, bağlayıcı oligonükleotidler kullanmaktan kaçınır ve aynı zamanda Novo LINE-1 eklemeleri için 5 ‘ ve 3 ́ kavşlarını aynı anda güçlendirebilir. Hat-1 ekleme, hedef site entegrasyonu, polyA kuyruğu ve hedef-site modifikasyonları, her biri LINE-1 retrotranspozis, her ikisi de 5 ‘ ve 3 ‘ kavşağıyla ilgili bilgiler, LDı-PCR tek molekül ile bağlama ile elde edilebilir uzun okunan sıralama teknolojileri. Uzun okur böylece oluşturulan eklenen LINE-1 sıra, benzersiz etiketi ve hedef sıraları tek bir okuma, Çift eşleme sorunları, tekrarlayan bölgede kısa okur.
SATıR 1 etkinliğini algılamak için LDı-PCR kullanmanın iki büyük kısıtlaması vardır. İlk PCR doğaldır: sadece güvenli bir şekilde 10 KB boyutunda parçaları yükseltmek olabilir. Yerel parça bu sınırı aşmamalıdır gibi kısıtlama enzim (ler), seçerken bu dikkate alınmalıdır. İkincisi, bu yöntem yalnızca satır-1 ‘ i n 3 ‘ yan bölgesini 3 ‘ transmetitle seferber eden retrotranspozite olaylarını algılayabilir. Bu nedenle, bu hat-1s aktivite 3 ‘ dönüştürücü sergileyen bu yöntem kullanılarak algılanacaktır değil. Ayrıca, LDI-PCR tarafından güçlendirilmesine rağmen, (a) “yerli” konum veya diğer retrotranspozitlerle veya (b) nadir veya subclonal olarak benzer boyutta bir PCR hedefi üreten, bazı LINE-1 retrotransposition olaylar agaroz jel tarafından algılanamayabilir Elektroforez. Bu tür satır-1 retrotransposition olayları tek molekül uzun okunan sıralama teknolojileri14kullanarak LDI-PCR ürün sıralamayı tarafından yakalanabilir.
Burada açıklanan iş akışı, uygun bir kısıtlama enzimi kullanarak diğer “sıcak” satır-1s etkinliğini algılamak ve bu LINE-1s ‘ i hedefleyen ters astar tasarımı yaparak kolayca değiştirilebilir. LINE-1 aracılı 3 ‘ dönüştürücü tespitine ek olarak, bu yöntem daha az sıklıkta hat-1 aracılı 5 ‘ dönüştürücü23‘ ü tespit etmek için uyarlanabilir. Benzer yöntem, hücre tabanlı deneyleri24 ve kanser25proviral entegrasyon siteleri LINE-1 gazetecilerin entegrasyon site tanımlamak için kullanılmıştır. SATıR-1 eklemeler yanı sıra, bu yöntem de diğer genomik sapmaları algılamak için kullanılabilir, DNA yeniden düzenlemeleri gibi, burada yeniden düzenleme eğilimli bölge ile ilgili bilgiler önceden var26.
The authors have nothing to disclose.
Biz bu yöntem ilk14, özellikle Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara ve ESA Pitkänen değerli tartışmalar için yöntem geliştirirken açıklanan makalede tüm ortak yazarlar teşekkür etmek istiyorum. L.K. Finlandiya Akademisi (Grant numaraları 25996, 292789, 306026 ve 314394), Sigrid Juselius Vakfı ve Finlandiyalı Kanser Derneği tarafından finanse edilmektedir. Tansiyon, Helsinki Üniversitesi Araştırma Vakfı doktora öğrencisi, Finlandiyalı Kanser Derneği tez hibe ve Ida Montinin Säätiö ‘den doktora araştırması hibe sahibidir. Ayrıca L.K. ‘in araştırma grubundan Teemu masalin ‘e (Helsinki Üniversitesi) ve kul Shrestha ‘ya video üretimiyle bize yardımcı olmak için teşekkür ederiz.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |