本研究描述了使用薄脂膜方法进行纳米脂质制备的经典水化,然后是纳米粒子表征。一种47 kDa亲水性和球状蛋白,塔林,被成功地封装为一种策略,以提高稳定性,避免快速清除,并促进受控释放。该方法可适用于疏水分子封装。
脂类纳米胶囊已应用于制药、化妆品和食品行业。脂质体的属性包括其生物相容性、生物降解性、非免疫原性、非毒性以及诱捕亲水性和疏水性化合物的能力。有机溶剂中薄脂膜的经典水化技术,作为在纳米脂质体中封装植物黄体素的技术。详细介绍了纳米脂质的大小、稳定性、诱捕效率和形态特征。纳米脂质体是使用1,2-二氧化铝-sn-甘油-3-磷乙醇胺(DOPE),1,2-二苯酚-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-氨基(聚乙烯乙二醇)-2000](铵盐;DSPE-MPEG 2000),和胆碱二聚丙酸酯(CHEMS)为主要成分。脂质首先溶解在氯仿中,以获得一种薄脂质膜,然后再水化在含有蛋白质的硫酸铵溶液中,在一夜之间被诱捕和孵育。然后,应用声波和挤出技术来生成纳米大小的单片囊泡。纳米晶片的大小和多分散度指数由动态光散射决定,而纳米晶菌形态通过扫描电子显微镜评估。诱捕效率由未封装的蛋白质量与最初加载的蛋白质的原始量之比决定。均质脂质体的平均尺寸为155nm,多分散指数值为0.168。实现了83%的高诱捕效率。
近年来,调查高效药物输送系统的研究数量有所增加。然而,诸如快速清除、生物分布不良、生理pH值溶解性以及细胞接受不足等限制仍有待超越。纳米系统的使用已成为癌症治疗的最新进展,用于增加癌细胞内药物细胞内浓度,同时尽量减少健康细胞的毒性。此外,从不同材料范围(即聚合物、花边、脂质体、病毒、碳纳米管以及氧化铁和黄金等金属)获得的纳米颗粒目前正在用于增强抗癌效果和减少系统性毒性1.脂类纳米胶囊尤其适用于制药、化妆品和食品行业。近年来,各种营养产品,如维生素,酶,和草药提取物已经配制使用脂质体技术2。
脂质体是球形囊泡,由一个或多个同心脂质双层组成,由磷脂在水介质中分散自发形成3、4。磷脂的极性头位于膜的外表面和内表面,与水环境接触。相反,脂肪酸链形成膜的疏水核心,并免受水5。脂质体的某些属性,使他们有吸引力的药物输送系统包括其生物相容性,生物降解性,非免疫原性,无毒性,以及捕获亲水性和疏水性化合物的能力6。
脂体可以使用各种过程步骤制备,如搅拌、声波、挤出、冻干、冷冻和解冻。经典方法包括逆相蒸发、溶剂注射和洗涤剂透析。应用最多的方法是薄脂膜水化,又称邦汉姆法,用于获得7、8、9、10、11的脂质形式。层状(磷脂双层的数量)和颗粒大小是经典参数,用于将脂质体表征为 1) 单片体囊泡 (ULVs),由独特的磷脂双层形成,大小变化如下:i) 小型单层体囊泡 (SUV, ±0.02-0.20 μm), ii) 大型单拉梅拉囊泡 (LUV, ±0.2-1.0 μm), 和 iii) 巨大的单拉他拉囊泡 (GUVs, >1 μm);或 2) 多拉梅拉囊泡 (MlV, >0.1 μm)3,12.囊泡大小是考虑用于治疗用途时的重要参数,如在癌症治疗中,其中<200 nm的大小是理想的允许纳米囊块穿过内皮屏障并到达肿瘤组织4。
在此,使用塔林(一种植物性球蛋白,特征为亲水球蛋白13、14、15)描述在薄膜薄膜技术7的经典水化之后的封装过程.纳米大小的囊泡是通过将声波和挤出步骤纳入主要技术来生产的,从而产生稳定的脂质体纳米囊泡,具有高诱捕效率16。
科雷亚等人16日测试了本文所述的抗肿瘤素,这是一种从科洛奇亚埃斯库伦塔22中纯化的免疫调节和抗肿瘤肠素。该方法取得了成功的结果,使生产稳定纳米脂体适合治疗应用。该配方在生理条件下以不同的pH水平提供受控释放。它还可以强化塔林药理特性,如抑制人类胶质细胞瘤U-87MG和乳腺癌MDA-MB-231细胞系和刺激小鼠骨髓细胞。脂质体制剂在健康小鼠细胞中无毒性作用。
班汉姆等人首先描述的古典方法,允许生产大型多拉梅拉脂质体囊泡,大小和形状异质。如本研究所报道,通过包括通过0.2 μm聚碳酸酯膜进行声波和挤出等附加步骤,成功地应用了这种方法的适应。这允许在纳米范围16,23,24中产生一个更均匀的色散。因此,为了确保成功的结果,应严格遵守此处描述的封装协议和脂质体配方。
纳米脂体组合物经过精心挑选,以确保形成以DOPE、MPEG 2000-DSPE和CHEMS为主要成分的双层膜。这些是天然动物膜双层成分,后者可赋予纳米脂质结构流动性,确保生物活性化合物在人类中的广泛应用。
纳米脂质体钉化对于保证脂质体结构稳定性至关重要。PEG的缺失导致尺寸增大、多分散度指数高、诱捕效率低。以DOPE为主要脂体组分组,可以获得最佳效果。然而,这是一种高成本的磷脂。纳米脂质生产的财务成本可以通过用其他类似的脂质(如DOPC(1,2-二氧化二醇-sn-甘油-3磷胆碱)取代DOPE来实现。CHEMS是一种天然存在于动物细胞膜中的胆固醇分子,不应排除在配方之外,因为确保脂质双层流动性和可延展性非常重要。
封装协议的其他方面也可以调整。用于溶解脂质体成分的氯仿可以很容易地被甲醇取代,对大小平均、均匀性和诱捕效率没有影响。然而,在4°C16下储存时,可能会出现一些蛋白质泄漏。含有塔林的硫酸铵溶液的过夜孵化步骤不是强制性的;然而,为了方便起见,它可以在不受纳米脂质生物物理特性、封装或稳定性效率损失损害时进行,如Correa等人16所证明的那样。挤出步骤在室温下执行,如果使用 0.1 μm 孔径膜,可降低注射器之间的流速。
为了克服这个问题,应考虑使用0.2 μm孔径膜或加热超过脂质过渡温度的挤出机支架。分析人员必须小心,不要损坏脂质或蛋白质,这些脂质或蛋白质可以灭活,并失去生物活性。或者,脂质体制剂可以针对HBS进行透析,而不是超离心,根据蛋白质分子量使用截断膜。在超离心后悬浮的缓冲液的化学性质选择与其后续应用直接相关。由于这项研究的视角包括体内和体外检测,HEPES缓冲盐水中的悬浮液足以确保无细胞毒性作用和接近生理条件的pH范围。
脂质体应经过精细处理,类似于活细胞,以获得更高质量的SEM图像。固定和干燥程序对于确保在真空条件下支持高于 20 kV 值的较小完整囊泡的可视化非常重要。图 2A,B显示与挤出程序兼容的纳米大小的囊泡。如果按照此过程进行充分的样品制备,则可以可视化 51-396 nm 的囊泡。这些步骤包括固定、通过增加乙醇浓度干燥以及化学脱水,以避免真空和电子束引起的聚集体和破裂的囊泡的形成。另一方面,图2C,D显示脂体囊泡在室温下干燥,没有接受此处描述的任何处理,这意味着它们准备不足。由于程序不当,即使通过0.2 μm孔径膜挤出后,也会形成巨大的囊泡。由于真空和电子束损坏,两个面板中也观察到破裂的囊泡。
纳米脂质囊泡已被探索为疏水性分子的封装和传递系统,包括白藜芦醇(3,5,4′-trihydroxystilne),一种生物活性化合物对抗结肠直肠癌细胞。封装程序除了提供脂质体纳米胶囊25固有的生物相容性、生物降解性、非免疫原性和非毒性特性外,还可以克服亲脂化合物的溶解度差。必须根据管理途径和目的考虑对议定书的适应,例如开发用于口服的新的脂体制剂配方。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢COPPE/UFRJ、电子显微镜实验室和多用户材料特征化实验室设施;向巴西里约热内卢联邦大学的阿达尔贝托·维耶拉博士、詹妮弗·洛博士和拉斐尔·林多索教授介绍使用超离心机;给巴西里约热内卢联邦大学的教授亚历山大·盖德斯·托雷斯博士和丹尼尔·佩罗内博士,用于使用旋转蒸发器;向来自柏林弗雷埃大学的罗兰·博德迈尔教授和安德烈·达舍夫斯基博士介绍,他们帮助获得资源,提供了新的方法,并在德国为期6个月的伊拉斯谟®奖学金期间监督了ACNTF;致巴西里约热内卢联邦大学教授兼技术员罗莎娜·蒂雷博士和阿琳·费尔南德斯博士,使用泽塔西泽·马尔文;致巴西里约热内卢联邦大学教授兼技术员布鲁玛·根特和塔伊萨·罗德里格斯,供SEM使用;给雷切尔·安·豪瑟·戴维斯博士,奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会研究员,进行旁白。这项研究部分资金来自巴西高级银行(CAPES)财政法001(第1627392号;1811605号赠款);由基金会卡洛斯·查加斯·菲略·德安帕罗 – 佩斯奎萨多埃斯塔多里约热内卢(FAPERJ)(赠款号)E-26/202.815/2018;E-26/202.815/2018;E-26/203.039/2015和E-26/202.860/2016);由国家科学委员会(CNPq)(第406601/2018-6号)和菲南西亚多拉·德普罗耶托斯(FINEP)撰写。
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |