Summary
デュアルDNA定規アッセイは、形成されたDNA-mRNA二重鎖の解離力に依存するリボソーム転位時のmRNA位置を決定するために開発される。単一ヌクレオチド分解能とmRNAの両端に到達する能力を備え、リボソーム転位およびプローブ他の核酸変位に関する機械的洞察を提供できる。
Abstract
リボソーム転位とは、タンパク質合成の中心的なステップである正確に3つのヌクレオチド(nt)によるmRNA上のリボソーム運動を指す。そのメカニズムを調査するには、2 つの重要な技術的要件があります。1つ目は、フレームシフトからの通常の転位を解決できるシングルnt解像度で、その間にリボソームが3nt以外で移動します。2つ目は、mRNAの入口側と出口側の両方を調べ、転移の全体像を解明する能力です。我々は、強制誘発残留磁化分光法(FIRMS)によって得られたDNA-mRNA二重鎖の臨界解離力に基づく二重DNA定規アッセイを報告する。 2-4 pN力分解能を使用すると、デュアルルーラーアッセイは異なる転位ステップを区別するのに十分です。プローブDNに長いリンカーを実装することにより、リボソームの反対側のmRNAに到達できるため、mRNAの位置を両側で決定することができます。したがって、デュアル定規アッセイは、リボソーム転位、および核酸運動全般を調べるのに一意に適している。ループmRNAの立体構造を示し、フレームシフトからの正常な転位を解消した代表的な結果を示す.
Introduction
生体分子変位は、関連する生物学的機能のメカニズムを研究する上で基本的なパラメータである。1つの特定の例は、リボソーム転位1、2、その間にリボソームがメッセンジャーRNA(mRNA)上で正確に3つのヌクレオチド(nt)によって、および1つ、2つ、または3を除くntの他の数によって移動する。フレームシフト。したがって、異なるステップサイズを区別するために、分子定規システムシングルNT分解能が必要です。より大きな課題は、入口側と出口側の両方でリボソームの動きを調べ取ることです。言い換えれば、デュアルルーラーシステムでのみ、mRNAがリボソームを通してスムーズに通付けされているのか、または両側が異なるステップサイズを持ち、内側のmRNAの立体構造を引き起こしているのかを明らかにすることができます。リボソーム。
リボソームの出口側(mRNAの3'末端)の異なるステップを解決する最初の課題に対処するために、いくつかの方法が開発されました。デュアルルシフェラーゼアッセイは、得られた異なるタンパク質3、4の比率を測定することによって、異なる読み取りフレームを解決します。これは、mRNAの3'末端にのみ適用可能であり、したがって、転位の全体像を提供するには不十分です。質量分析は、対応するコード再配置5の結果として異なるペプチド断片を分析することができる。しかし、リボソームがmRNA上でどれだけのntを動かすかを特定することはできません。つま先印刷アッセイは、3'-遠位端でプライミングされた逆転写酵素を使用して、リボソーム6に向かってmRNAを転写するもう一つの一般的な方法である。しかし、リボソームに入っているmRNAの5'末端には適用できない。単一分子アプローチおよび蛍光法7を含む他の技術は、単一nt分解能を達成することは困難である。
我々は、リボソーム-mRNA複合体における未発見のmRNAの入り口と出口位置の両方を一意に決定できるデュアルDNA定規アッセイを開発した。 定規DNAは、mRNAのどちらの端に関係なく、リボソームによって発見されたmRNAと一定数の塩基対(bp)の二重鎖を形成するDNAオリゴマーである。bp番号は転移の間にmRNAのリボソームの位置を正確に明らかにする。二重鎖のbp数は、力誘発残留磁化分光法(FIRMS)8から得られた重要な解離力によって決定される。2-3 pN力の不確実性では、臨界力は単一nt分解能を提供するのに十分である。DNA定規にリンカー分子を実装することにより、リボソームによるmRNAの立体的に妨げられた側をプローブすることができる。異なるリボソーム変位は、したがって正確に解決することができる。我々は、転移9の間に抗生物質によって捕らえられたmRNAのユニークなループされた立体構造を明らかにし、滑りやすいmRNA配列10上で共存した異なる読み取りフレームを解決した。この記事では、リボソーム複合体の調製、ガラススライドの表面機能化、リボソーム複合体の固定化、磁気標識されたDNA定規によるハイブリダイゼーションを含むデュアルルーラーアッセイの詳細について説明します。分子、磁気検出、およびフォーススペクトル分析を行います。
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Protocol
1. リボソーム複合体の調製
- 20 mMトリス-HCl(pH 7.5)、10 mM Mg(OAc)2、30 mM NH4Cl、70 mM KCl、5 mM EDTA、7 mM BME(2-メルカプトエタノール)、および0.05%Tween20で構成されるTAM10バッファの1,000 mLを作ります。
- 表 1に示す 5 つの混合物を準備します。
注:リボソームはMRE600株11からであった。EF-Tu:伸び係数サーモ不安定。EF-Ts:伸び因子サーモ安定。GTP: グアノシン三リン酸.PEP: ホスホ(エノール)ピルビン酸。 - リボソーム複合体を作る前に、5つのミックスを37°Cで25分間別々にインキュベートします。表 2に示すように、5 つのリボソーム複合体を準備します。
注: ポスト: ポスト転移;前:転移前。 - 5つのリボソーム複合体をそれぞれ1.1Mスクロースクッションに別々に追加し、容積比は1:1です。超遠心分離機で2時間450,000×gでそれぞれを浄化します。 ピペを使用して上清を除去し、TAM10バッファーでペレットを再懸濁した後-80 °Cでリボソーム複合体を復元します。
2. ビオチンコーティングガラススライドの調製
- ガラススライドの予備洗浄
- 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 (L × W × T) の短くて広いガラス皿に 12 枚のガラススライドを配置します。
- ガラス皿にアセトンと超音波処理器を5分間充填します。その後、5回超純水でスライドを洗浄し、水で皿の3/4を充填します。
- 皿を満たすために10 M KOHを追加し、20分間ガラススライドを超音波処理し、水でスライドを5回洗います。
- エタノールと超音波を5分間加え、エタノールを注ぎ、3時間300°Cで別々に乾燥させます。
- アミノシランコーティング
- 12個の洗浄されたスライドをメタノールを含むガラス皿に戻します。5分間超音波処理してメタノールでペジル化フラスコをきれいにし、25 mLメタノール、1.25 mL水、0.125 mL HAc、0.25 mL 3-アミノプロピルトリエトキシシラン(AMEO)で満たします。
- すぐに準備されたAMEO溶液でガラス皿のメタノールを交換してください。室温で30分間インキュベートします。
- スライドを水で数回すすいでから、窒素パージで乾燥させます。乾燥したスライドを清潔なガラス皿に入れます。
- ペグレレーション
- NaHCO3溶液(8.4mg/mL)およびペグリング化バッファー(37.5mg PEG、6mgバイオチリン化PEG、150μL NaHCO3溶液)を調出す。6,000 rpmで1分間回転させてよく混ぜます。
- 各スライドに25 μLのPEG溶液を配置します。上の他のスライドでそれをカバーします。2 つのスライドの間に気泡がないことを確認します。 スライドを空のピペットチップボックスに入れます。箱が水平にされ、約3時間暗い引き出しに置かれてください。
- スライドを水ですすいで、もう一度乾かします。乾燥したスライドを真空下で2週間まで室温で保管します。
3. 磁気および力の測定前のサンプル準備
- 寸法4×3×2mm3(L×W×D)でプラスチック試料を十分に加工します。 エポキシを使用して底面にビオチンコーティングガラス(長さ約5mm、セクション2で調製した60mm長いスライドから切り取る)を接着します。
- 0.25 mg/mLのストレプトアビジン水溶液を20 μLをサンプルウェルに加え、室温で40分間インキュベートします。次に、TAM10バッファーでサンプルを 2 回よくすすいでいます。
- リボソーム複合体を固定します。
- 抗生物質なし:ピペットを使用してサンプルウェルからバッファーを除去し、0.1 μMリボソーム複合体(MF-PreまたはMF-Post)の20 μLをサンプルウェルに加えます。リボソーム複合体は、mRNA上の5'エンドビオチンを介して表面上のストレプトアビジンと結合します。37°Cで1時間インキュベートし、TAM10バッファーで1回すすいで下します。
- ネオマイシンとフシジン酸の両方を用いて実験を行う場合:MF-Pre複合体をネオマイシンで10分間37°Cでインキュベートする。EF-Gを37°Cでフシジン酸で20分間インキュベートします。濃度は、0.1 μMリボソーム複合体、2 μM EF-G、4 mM GTP、4 mM PEP、0.02 mg/mLピルビン酸キナーゼ、0.2mMネオマイシン、および0.25mMフシジン酸です。
- 他の抗生物質実験も同様に行う。濃度は、0.2mMビオマイシン、0.4mMハイグロマイシンB、および0.25mMフシジン酸です。
- フレームシフト研究では、滑りやすいモチーフU6Aを含むMFNF-PreおよびMFNF-Post複合体の上記の手順を繰り返し、それぞれ抗生物質フシジン酸とネオマイシン、およびフシジン酸を単独で使用する。
- サンプルウェルから緩衝液を取り出し、1μMのビオチン化プローブDNA鎖の20 μLを追加し、室温で一晩インキュベートします。TAM10バッファーで形成されたDNA-mRNAデュプレックスを1回すすいで下します。
- サンプルウェルからバッファを取り外します。次に、0.5mg/mLの20 μLをサンプルウェルに加え、室温で2時間インキュベートします。
- 慎重にサンプルをホルダーによく挿入し、遠心分離機に入れておきます。84 x gで5分間遠心分離して表面から自由な磁性粒子を取り除きます。
4. 磁気と力の測定
- レーザーをオンにする
- キーを使用してレーザーの電源を入れます。次に、電源ボタンを押します。
- ロックインアンプ1(LIA1)の感度を500mVに調整し、約2時間待って原子磁力計を温めて安定させます。
- 原子磁力計の設定
- 計測器制御ソフトウェアを実行し、測定パラメータを設定します。一部のパラメータは、測定ごとに若干異なる場合があります。
注:原子磁力計は、レーザー(上述)、SR830ロックインアンプ(LIA1と呼ばれる)、SR530ロックインアンプ(LIA2と呼ばれる)、DS345(FG1と呼ばれる)およびATF20B(FG2と呼ばれる)、高解像度の機能発生器で構成されています。モーターとコンピュータ。これらのすべてを、プロトコルのこのステップでオンにする必要があります。 - モータ移動モードをノイズに設定し、デフォルトの位置を0に設定します。フロントパネルのロックを押し、LIA1の感度を200mVに戻します。
- レーザーの電流と電圧を調整し、適切な共振ピークと信号対雑音レベルを見つけます。前面パネルのスイープを押します。振幅/幅比は 0.5 を超え、位相値は 5 度未満にする必要があります。そうでない場合は、スイープ ステップを再行します。
- その周波数をロックするためにレーザーのフィードバックにLIA2の出力をプラグインします。このアンプは、共振12上のレーザー周波数を維持するために補助セシウムセルの光学回転を測定します。状態は測定が終了するまで残ります。
- プラグイン機能ジェネレータFG2は、基準信号として正方形波(500mVpp、100mHz)を入力します。正方形波は100 pTに対応し、アンプの現在の出力を磁気信号に変換するために使用されます。関数ジェネレータを取り外します。
- モータ移動モードを双方向およびデフォルト位置 260 mm に設定します。
- 空のサンプルホルダーの信号を2回測定して、システム全体の安定性を確認します。2 つのトレースを減算した後の安定性とノイズ レベルを評価します。一般的なノイズレベルと変動は、30ミリ秒の積分時に±2 pTである必要があります。
- 計測器制御ソフトウェアを実行し、測定パラメータを設定します。一部のパラメータは、測定ごとに若干異なる場合があります。
- サンプルの磁化
- サンプルを磁化ステーションにそっと置き、2分間滞在させます。
注:磁化ステーションは、永久磁石(〜0.5 T)とプラスチックスペーサーで構成されています。 - サンプルをサンプルホルダーに戻します。335.4 × g遠心力を使用して、非特異的に結合した磁性粒子を除去します。
- サンプルを磁化ステーションにそっと置き、2分間滞在させます。
- 力を加え後の磁気測定
- ピンセットを使用して、サンプルをモーターにロードします。プログラムを実行するには、前面パネルの [ロック] をクリックします。一方、ピンセットを使用して他のサンプルをホルダーにロードし、遠心分離機に置きます。コーティングされたガラス側は遠心分離機の中心に面する必要があります。
注:力誘発残留磁化分光法(FIRMS)の技術を使用し、原子間磁力計を使用して、サンプル内の分子相互作用に機械的な力を加えた後にサンプルの磁気信号を測定します。ここで、分子相互作用は、リボソーム複合体におけるDNA定規分子とmRNAとの間にある。力は遠心速度を上げることによって段階的に増加する。各力を加える後、モーターは原子センサーにサンプルを翻訳し、後ろに移動する。したがって、2つの磁場プロファイルが得られ、1つは前方スキャン中、もう1つは後方スキャン13中である。信号対雑音比が良いため、後者のみを使用してピーク高さを抽出します。電流(nA)のピーク高さは、キャリブレーションスクエア波に基づいて磁気信号振幅(pT)に変換されます。 - すべての測定はおよそ5分続く。モータが 0 に戻ったら、前面パネルの[保存]をクリックします。ピンセットを注意深く使用して、モーターや遠心分離機からサンプルを採取してください。335.4 × g (2000 rpm、材料の表に記載されている遠心分離機の 1 分あたりの回転数) に対応する初期速度を使用します。
- 2つのサンプルを交換し、遠心速度を100rpmまたは同様のステップサイズで増加させることによって、より強い力を適用します。徐々に力を高めるために交互に処理します。完全な力スペクトルは10-12データポイントの後に得られる。
- ピンセットを使用して、サンプルをモーターにロードします。プログラムを実行するには、前面パネルの [ロック] をクリックします。一方、ピンセットを使用して他のサンプルをホルダーにロードし、遠心分離機に置きます。コーティングされたガラス側は遠心分離機の中心に面する必要があります。
- 実験の終了
- 計画されたすべての実験が完了したら、機器の電源を切り、電源を入れたときに逆の順序で進めます。
- ホルダーからサンプルを取り出し、エタノールに浸して洗浄し、将来使用してください。磁気ビーズ汚染の場合は、アセトンでサンプルホルダーをクリーンアップします。
- データ分析
- Python 分析スクリプトを開き、すべての実験データを入力します。[四角形をロード] をクリックして、四角形を参照として入力します。次に、[ベースラインをロード]をクリックして、残留磁気信号をバックグラウンドとして入力します。
- 全体的な磁気信号の減少をB0として定義します。各磁気信号を正規化するとBからB0に減少し、パーセンテージで表現します。パーセント (B/B0)と遠心力をプロットして、企業スペクトルを取得します。
注:遠心力Fは、磁気ビーズm(4.6×10-15kg)、遠心速度w、遠心rの半径(ここでは7.5cm)の方程式F =m wの浮力質量から計算されます。 2r.典型的な力の決断は2-4 pNであり、力の範囲はこの仕事で15-95 pNである。
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Representative Results
図1は、主要成分の検出スキームと写真を示す。磁気検出は、走査方式(図1A)13を用いて原子磁力計によって達成される。サンプルは線形モーターに取付けられる棒の上に置かれる。モーターは磁気シールドの中の原子センサーにサンプルを運び、それから荷を下すために元の場所に戻る。原子磁力計は、サンプルスキャン中に磁気信号を検出し、サンプルがセンサーに最も近いときに最大信号で信号トレースを生成します。図 1Bは、全体的な楽器の写真を示しています。図1C,Dは、それぞれ力の適用に用いられる磁化ステーションと遠心分離機の写真を示す。
二重DNA定規アッセイの原理を図2に示す。リボソーム複合体は、mRNAの5'末端を介して表面に固定化される。2つのDNA定規は、リボソームの正確な位置をプローブするように設計されており、mRNAの各側に1つずつ使用します。現在の固定化スキームは、3'側をプローブDNA定規に簡単にアクセスできるようにします。したがって、磁気ビーズと結合したDNAオリゴマーは、未明のmRNAと二重鎖を形成することができる。しかし、5'側は、リボソームと表面によって立体的に妨げられる。したがって、DNAがこの側で未発見のmRNAに到達するためにはリンカー分子が必要です。リンカーの長さを変えることで、リンカーが50Tより長い場合、DNA-mRNA二重鎖の形成に成功したことを示す強い磁気シグナルを検出できると判断しました(図2B)。解離力と二重長との相関は、mRNAに相補的なDNA上のntの数を変化させることによって達成される。図2C,Dはそれぞれ3'--及び5'-側の相関を示す。連続した長さの二重間の力の差は通常12-20 pNであり、力の分解能は通常2-4 pNであるため、我々は日常的に解離力に基づいてDNA-mRNA二重鎖の長さに対する単一nt分解を達成する。
図3は、種々の抗生物質の不在および存在における正常な転位の結果を提示する。転移はMFプレからMFポスト(図3A)です。このインセットは、MF-PreがP-およびA部位でそれぞれ空いているtRNAfMetおよびMF-tRNAPheを運ぶことを示す。MFポストは、それぞれTRNAfMetおよびMF-tRNApheをE-サイトおよびP部位に運び、空いているAサイトを持つ。図 3Bは、抗生物質なしで、リボソームが両側で3ntずつ動く(3'-endに向かって移動する)ことを示す。これは、(i)5'側のDNA-mRNA二重鎖がそれぞれMF-PreおよびMFポストにおいて12bpおよび15 bp結合力を示す理由である。(ii) 3' 末端の二重は、15 から 12 bp (図 3 C) に反転した変化を示します。しかし、フシジン酸とネオマイシンの両方が存在する場合、力スペクトルはリボソームが5'側で1ntだけ、3'側で2ntだけ動くことを示す(図3D,E)。この結果は、リボソームが段階的なメカニズムを介して転移し、リボソーム内部に余分なntを有するループmRNA立体構造が生じ、これまで実験的に明らかにされていないことを示している。これは、報告された理論シミュレーション14と一致しています。あるいは、リボソームは、通常の27nt15の代わりに、mRNAの28ntをカバーするように伸ばされてもよい。抗生物質を洗い流した後、5~3~の両側から3ntの動きによって証明されるように、正常な転座が起こる(図3D、Eの紫色の痕跡)。フシシド酸のみを使用する場合、ループされた立体構造は形成されません。力スペクトルは、通常の転位の状況と同様に、両側の3ntのリボソーム運動と一致する(図3F,G)。デュアル定規アッセイはまた、両側の0 nt運動によって示されているように、ビオマイシンが完全に転位を阻害することを明らかにする(図3H,I)。
また、このループコンフォメーションが「-1」フレームシフトモチーフに形成できるかどうかも検討しました。ここでは、MFNF-PreおよびMFNF-Post複合体からの転位は、HIV16の'-1'フレームシフトモチーフの一部であることが判明した「U6A」モチーフで行われます。図4A,Bは、MFNFポストにおいて、DNA-mRNA二重鎖が3'終端で2または3ntのいずれかによって短縮されたことを示す。デュプレックスの長さは、5 つの端で 2 または 3 nt ずつ増加します。この結果は、通常の転位と「-1」フレームシフトの両方の共存を示唆しており、前者は3-ntの動きと相関し、後者は2-ntの動きと相関する。二重定規アッセイは、2つの母集団を明確に解決することができる。ネオマイシンとフシジン酸の両方を使用して、リボソームが3'末端で2ntずつ動くが、それぞれ5°終端では1ntだけ動いていることを観察する(図4C,D)。したがって、ループされたmRNAの立体構造も滑りやすい配列上で起こる。MFNF-Pre(図4E,F)にフシジン酸のみが存在する場合、結果はパネルAおよびB(青色の微量)におけるMFNF-Postの場合と同じであり、フシジン酸だけでは転座またはフレームシフトを一時停止するのに十分でならないことを示す。従って、mRNAの両側に対する不均等な変位にはフシジン酸とネオマイシンの両方が必要であることを確認した。
図 1: FIRMSベースのデュアルDNA定規アッセイ用の器具。(A) 磁気検出の概略図。1:サンプルとそのマウント。2:モータ;3:原子センサーと磁気シールド。(B) 原子磁力計とサンプル取り扱いシステムの写真。数字は、回路図に示されている実際の対応するコンポーネントを示します。磁気シールドは、熱安定性を向上するために段ボール箱の中にあるのに注意してください。(C) 磁化ステーション。(D) 力の適用のために使用される遠心分離機。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: リボソーム転位を研究するためのシングルnt解像度を持つデュアル定規アッセイ。(A)2つのDNA定規がそれぞれ5~及び3の終端をプローブするように設計された二重定規アッセイの概略図。赤い線はポリTリンカーを示します。(B) ルーラーイン (C) のリンカー長の最適化結果を使用して、Ruler-Ins と mRNA の二重鎖の解離力を決定します。 (D) ルーラーアウトとmRNAの二重化の解離力。誤差バーは、計測器のノイズと全体的な磁気信号減少(B 0)の比率として定義され、典型的な値は±3~5%です。●フィギュアは許可9で再現されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:様々な抗生物質の影響下で転位ステップを調査する。(A) MF-Pre および MF ポスト複合体のプロービング スキーム。インセットは、それぞれソリッドとダッシュ線の楕円に対応する Pre と Post の概略リボソームを示します。(B, C)企業は抗生物質なしで結果を出す。(D, E)フシジン酸とネオマイシンの両方の結果.(F, G)フシド酸のみの結果。(H, I)ビオマイシンのみでの結果。左パネル:ルーラーインを使用して5'側をプローブします。右パネル:ルーラーアウトを使用して3'側をプローブします。誤差余数は、前の図と同じ方法で計算されます。●フィギュアは許可9で再現されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: デュアルルーラーを使用してフレームシフトをプローブした結果。(A, B)抗生物質なしのMFNF-プレおよびMFNFポスト。(C, D)フシジン酸とネオマイシンの両方の結果.(E, F)フシド酸のみを使用した結果。左パネル:ルーラーインを使用して5の側をプローブします。右パネル:ルーラーアウトを使用して3~側をプローブします。誤差余数は、前の図と同じ方法で計算されます。●フィギュアは許可9で再現されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
私たちのデュアル定規アッセイでは、磁気ビーズは2つの重要な役割を果たしています。まず、遠心力は浮力質量に比例するため、力トランスデューサとして機能します。第二に、ビーズは、現在最も正確な磁気センサである原子磁力計によって検出された信号キャリアです。機械的操作と磁気検出を組み合わせることで、DNA定規の基礎となる重要な解離力に基づいて多数の分子相互作用を解決できます。二重定規のアッセイは転位の間にmRNAの両側を調査するのに独特に適する。それは二重鎖の形成だけに依存する物理的アプローチであるので、それはmRNA側または他の生物学的制約によって制限されない。これは、生化学反応に基づく他の技術と比較して有利である。我々は、長いリンカー分子を使用することにより、定規がmRNA位置を決定するために標的結合部位に到達できることを示した。具体的には、リボソームの場合、リンカー長は50Tであり、これは長さ17nmに相当する。この長さはリボソーム17の大きさに非常に近い。抗生物質の濃度は、文献からの典型的な値です。また、このメソッドを使用して、その関数の開始値を明らかにすることもできます。
デュアルルーラーアッセイには2つの重要な側面があります。一つは、分子固定化とその後の生物学的反応のための繊細な機能化された表面です。すべてのローディングと洗浄工程は、表面に固定された分子がそのまま残るように、表面への最小限の乱れで行われるべきです。DNA-mRNAハイブリダイゼーションプロセスでは、プロセスの完了を確実にするのに十分な時間が必要です。また、恒震システムを維持するために、余分な1 M NaClを備えたTAM10バッファを使用することをお勧めします。もう一つの重要な側面は、ビーズの磁化です。過剰なビーズが使用されているので、表面に固定されていないフリービーズがたくさんあります。したがって、試料を磁化する際には、被覆面が接近し、磁石を垂直方向に残す必要があります。サンプルの小さなスイングは、表面に傷の損傷を引き起こす可能性があります。
当社のデュアルDNA定規アッセイは、現在、単一nt分解能を持つリボソーム複合体内のmRNAの入口側と出口側の両方を客観的にプローブできる唯一の方法です。リボソーム転移に関する新しい機械的情報が得られた。この方法は、一般に、分子生物学で広く遭遇される核酸の分子変位に適用可能である。
将来の開発および応用のために、遠心力を置き換えるために音響放射力を使用すると、さらに力の分解能を改善し、サブNT政権18に達することを示した。また、原子磁力計を用いた多重検出も研究し、検出効率を向上させます。これらの改良により、本研究で詳述した手法は、生物研究における幅広い応用が期待されます。
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Disclosures
潜在的な利益相反は著者によって報告されなかった。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(R01GM111452、Y.W.、S.X.)によってサポートされています。Y. W. ウェルチ財団(E-1721)からの支援を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
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