Summary
Dual DNA linjal assay är utvecklad för att bestämma mRNA position under ribosom translocation, som förlitar sig på dissociation krafterna i den bildade DNA-mRNA duplex. Med single-nucleotide upplösning och förmåga att nå båda ändarna av mRNA, kan det ge mekanistiska insikter för ribosom flyttning och sond andra nukleinsyra förskjutningar.
Abstract
Ribosomen flyttning hänvisar till den ribosomala rörelsen på mRNA av exakt tre nukleotider (NT), som är det centrala steget i proteinsyntesen. För att undersöka dess mekanism finns det två väsentliga tekniska krav. Först är Single-NT upplösning som kan lösa normala flyttning från frameshifting, under vilken ribosom rör sig med andra än 3 NT. Den andra är förmågan att söka både ingångs-och utgångssidor av mRNA för att belysa hela bilden av translocation. Vi rapporterar Dual DNA linjal analys som är baserad på den kritiska dissociation styrkor av DNA-mRNA duplex, som erhållits genom Force-inducerad kvartningar magnetisering spektroskopi (företag). Med 2-4 PN-kraft upplösning är Dual Ruler-analysen tillräcklig för att särskilja olika flyttning-steg. Genom att implementera en lång länkare på sondering DNAs, kan de nå mRNA på motsatt sida av ribosom, så att mRNA position kan bestämmas för båda sidor. Därför är Dual Ruler assay unikt lämpad att undersöka ribosom translocation, och nukleinsyra rörelse i allmänhet. Vi visar representativa resultat som indikerade en loopas mRNA konformation och löst normala flyttning från frameshifting.
Introduction
Biomolekylär förskjutning är en grundläggande parameter i att studera mekanismen för de relaterade biologiska funktionerna. Ett särskilt exempel är ribosom flyttning1,2, under vilken ribosom rör sig med exakt tre nukleotider (NT) på budbäraren RNA (mRNA) normalt, och av en, två eller annat antal NT utom tre i fallet med ramväxling. Därför krävs en molekylära linjalsystem Single-NT-upplösning för att särskilja de olika steg storlekarna. En större utmaning är att söka efter ribosrörelsen på både ingångs-och utgångssidorna. Med andra ord, bara med ett dubbelt linjalsystem kommer vi att kunna avslöja om mRNA är smidigt gängade genom ribosom, eller det finns mellanliggande steg där de två sidorna har olika steg storlekar som leder till en böjd eller loopas mRNA konformation inne i Ribosomen.
Flera metoder har utvecklats för att ta itu med den första utmaningen att lösa olika steg på utgångssidan av ribosom (den 3 ' slutet av mRNA). Den Dual luciferas analysen löser olika läsbild ramar genom att mäta förhållandet mellan de resulterande olika proteiner3,4. Det är endast tillämplig för 3 ' slutet av mRNA och därmed otillräcklig för att ge en fullständig bild av translocation. Masspektrometri kan analysera de olika peptidfragmenten som en följd av motsvarande kod omordningar5. Men det kan inte peka på hur många NT ribosom rör sig på mRNA. Den Toe-Printing assay är en annan vanlig metod som använder en omvänd transkriptase primas på 3 '-distala änden att transkribera mRNA mot ribosom6. Emellertid, det är inte tillämpligt för 5 ' slutet av mRNA som går in i ribosom. Andra metoder, inklusive enkel molekyl metoder och fluorescensmetoder7, är svåra att uppnå Single-NT upplösning.
Vi har utvecklat Dual DNA linjal analys som kan unikt bestämma både ingången och utgångs positionerna för den avslöjade mRNA i ribosome-mRNA komplex. Linjalen DNAS är DNA-oligomerer som bildar duplex av bestämda numrerar av basepairs (BP) med mRNAen som avslöjts av ribodelen, oavsett som avslutar av mRNAen. BP siffrorna sedan exakt avslöja ribosom position på mRNA under translocation. BP numrerar av duplex är beslutsamt vid deras kritiska dissociationstyrkor som fås från tvinga-inducerad återstod magnetiseringsspektroskopi (firmor)8. Med 2-3 pN-styrka osäkerhet, de kritiska krafterna är tillräckliga för att erbjuda Single-NT upplösning. Genom att implementera en länkare molekyl på DNA-linjalerna, kan den sterically hindrade sidan av mRNA av Ribosomen vara probed. Olika ribosomal förskjutningar kan thus lösas exakt. Vi har framgångsrikt avslöjat en unik loopas konformation av mRNA fångade av antibiotika under flyttning9, och löst olika läsning ramar som samexisterade på en HAL mRNA sekvens10. Denna artikel beskriver detaljerna i Dual Ruler assay, som omfattar beredning av ribosom komplex, ytfunktionalisering av glaset diabilder, immobilisering av ribosom komplex och deras hybridisering med magnetiskt märkt DNA-linjal magnet detektering och kraftspektrum analys av företag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av ribosom komplex
- Gör 1 000 mL TAM10-buffert, som består av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4cl, 70 mm KCL, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-merkaptoetanol) och 0,05% Tween20.
- Bered de fem blandningar som förtecknas i tabell 1.
Anmärkning: ribosom var från MRE600 stammen11. EF-tu: tsträckning faktor Thermo instabil. EF-TS: förlängnings faktorn Thermo Stable. GTP: Guanosintrifosfat. PEP: Phospho (Enol) pyruvat. - Inkubera de fem blandningarna separat vid 37 ° c i 25 minuter innan ribosom komplexen. Bered de fem ribosom komplexen enligt tabell 2.
ANMÄRKNINGAR: post: post-translocation; Före: pre-translocation. - Tillsätt vart och ett av de fem ribosom komplexen på en 1,1 M sackaros kudde separat, med volymförhållandet 1:1. Rengör var och en med 450 000 × g för 2 h i en ultra-centrifug. Använd en Pipettera för att ta bort supernatanten och återställa ribosom komplex vid-80 ° c efter resuspension av pelleten med TAM10 buffert.
2. beredning av biotin-belagda glas diabilder
- Preliminär rengöring av glas rutschbanorna
- Placera 12 glas diabilder med måtten 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (L × b × T) i en kort och bred glasskål.
- Fyll glas skålen med aceton och Sonikera i 5 min. Tvätta sedan glasen med ultrarent vatten 5 gånger och fyll 3/4 av skålen med vatten.
- Tillsätt 10 M KOH för att fylla skålen och Sonikera glas rutschbanorna i 20 min. Tvätta glasen med vatten 5 gånger.
- Tillsätt etanol och Sonikera i 5 min, Häll ut etanol och torka dem separat vid 300 ° c för 3 h.
- Aminosilane beläggning
- Placera de 12 rengjorda glidningen tillbaka i glas skålen som innehåller metanol. Rengör en Pegylationskolv med metanol genom att sonicera i 5 min, fyll den med 25 mL metanol, 1,25 mL vatten, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
- Byt omedelbart ut metanol i glas skålen med den beredda AMEO-lösningen. Inkubera i rumstemperatur i 30 minuter.
- Skölj vattenrutschkanorna med vatten flera gånger och torka dem sedan genom kvävgasrening. Placera de torkade bilderna i rena glas rätter.
- PEGlation
- Förbered NaHCO3 lösning (8,4 mg/ml) och pegylationbuffert (37,5 mg PEG, 6 mg en PEG, 150 μl NaHCO3 lösning). Blanda dem väl genom att snurra på 6 000 rpm i 1 min.
- Placera 25 μL PEG-lösning på varje bild. Täck den med den andra bilden ovanpå. Se till att det inte finns några bubblor mellan de två bilderna. Placera bilderna i en tom Pipettera-Tip-box. Se till att boxen är planat och placera den i en mörk låda för ca 3 h.
- Skölj vattenrutschkanorna med vatten och torka igen. Förvara de torkade glasen i rumstemperatur under vakuum i upp till 2 veckor.
3. provberedning före magnetiska och kraftmätningar
- Maskin ett plast prov väl med måtten 4 × 3 × 2 mm3 (L × b × D). Limma en bit biotin-belagt glas (ca 5 mm lång, skuren från 60 mm långa diabilder som bereds i avsnitt 2) på bottenytan med epoxi.
- Tillsätt 20 μl 0,25 mg/ml konjugerat vattenlösning i provet väl och inkubera i rumstemperatur under 40 min. Skölj sedan provet väl två gånger med TAM10 buffert.
- Immobilisera ribosom komplex.
- Utan antibiotika: Använd en pipett för att ta bort bufferten från provet väl, tillsätt sedan 20 μL av 0,1 μM Ribosomen Complex (MF-pre eller MF-post) i provet väl. Ribosom komplexet kommer att binda med konjugerat på ytan via 5 '-End biotin på mRNA. Inkubera vid 37 ° c i 1 h och skölj sedan med TAM10 -bufferten.
- För experimentet med både neomycin och fusidinsyra: Inkubera MF-pre-komplexet med neomycin vid 37 ° c i 10 min; Inkubera EF-G med fusidinsyra vid 37 ° c i 20 min. Koncentrationerna är följande: 0,1 μM ribosom komplex, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/mL pyruvatkinas, 0,2 mM neomycin, och 0,25 mM fusidinsyra.
- Utföra de andra antibiotika experiment på samma sätt. Koncentrationerna är följande: 0,2 mM viomycin, 0,4 mM hygromycin B, och 0,25 mM fusidinsyra.
- För frameshifting-studier, upprepa ovanstående steg för komplexen MFNF-pre och MFNF-post med det hala motivet U6A. Använd antibiotika fusidinsyra plus neomycin, och fusidinsyra ensamt, respektive.
- Ta bort bufferten från provet väl, tillsätt sedan 20 μl av 1 μm en sondering DNA-sträng och inkubera i rumstemperatur över natten. Skölj den bildade DNA-mRNA duplex en gång med TAM10 buffert.
- Ta bort bufferten från provet väl. Tillsätt sedan 20 μL 0,5 mg/mL streptavidin-belagda magnetiska pärlor i provet väl och inkubera vid rumstemperatur i 2 h.
- Sätt försiktigt in provet väl i en hållare och placera det i en centrifug. Avlägsna de fria magnetiska partiklarna från ytan genom centrifugering vid 84 x g i 5 min.
4. magnetiska och kraftmätningar
- Slå på lasern
- Slå på lasern med hjälp av knappen. Tryck sedan på strömbrytaren.
- Justera känsligheten för lock-in förstärkare 1 (LIA1) till 500 mV och vänta ca 2 h för att värma upp och stabilisera atommagnetometern.
- Inställning av atommagnetometer
- Kör instrument styrningsprogram varan och Ställ in mätnings parametrarna. Vissa parametrar kan variera något i varje mätning.
Anmärkning: atommagnetometern består av en laser (beskrivs ovan), en SR830-lock-in förstärkare (kallad LIA1), en SR530 lock-in förstärkare (kallad LIA2), DS345 (kallad FG1) och ATF20B (kallad FG2) funktion generatorer, en högupplöst motor och en dator. Alla dessa bör slås på i det här steget i protokollet. - Ställ in motoriskt förflyttningsläge till brus och standardposition till 0. Tryck på Lås på frontpanelen, justera känsligheten på LIA1 tillbaka till 200 MV.
- Justera ström och spänning av lasern och hitta rätt resonans topp och signal-till-brus nivå. Tryck på svep på frontpanelen. Notera amplitud/breddförhållandet bör vara över 0,5 och fas svärdet bör vara mindre än 5 grad. Om inte, re-gör svep steg.
- Plug-in utdata från LIA2 till återkoppling av lasern för att låsa dess frekvens. Denna förstärkare mäter den optiska rotationen av en hjälpare cesium cell för att underhålla laser frekvensen på resonans12. Tillståndet kvarstår till slutet av mätningen.
- Plug-in funktion Generator FG2 att mata in en kvadrat våg (500 mVpp, 100 mHz) som referens signal. Den fyrkantiga vågen motsvarar 100 pT och används för att omvandla den nuvarande produktionen av förstärkaren till magnetisk signal. Koppla loss Funktions generatorn.
- Ställ in motoriskt förflyttningsläge till tvåvägs- och standardposition till 260 mm. Kontrollera status för temperaturregulatorn för att säkerställa rätt temperatur (~ 37 ° c) av Atom sensorn.
- Kontrollera stabiliteten i hela systemet genom att mäta signalerna från den tomma provhållaren två gånger. Utvärdera stabilitet och ljudnivå efter subtrahera de två spåren. Normal ljudnivå och fluktuation bör vara ± 2 pT vid 30 MS integrations tid.
- Kör instrument styrningsprogram varan och Ställ in mätnings parametrarna. Vissa parametrar kan variera något i varje mätning.
- Magnetizing provet
- Placera försiktigt provet på magnetiseringsstationen och låt det stanna i 2 minuter.
Obs: magnetiseringsstationen består av en permanent magnet (~ 0,5 T) och en plast spacer. - Sätt tillbaka provet i provhållaren. Använd 335,4 × g centrifugalkraft för att avlägsna ospecifikt bundna magnetiska partiklar.
- Placera försiktigt provet på magnetiseringsstationen och låt det stanna i 2 minuter.
- Magnetiska mätningar efter applicering av krafter
- Använd pincett för att lasta provet på motorn. Klicka på Lås på frontpanelen för att köra programmet. Under tiden, Använd pincett för att ladda det andra provet i hållaren och placera det i centrifugen. Observera att den belagda glas sidan ska vara vänd mot mitten av centrifugen.
Observera: tekniken med tvångsinducerad kvartningspektroskopi (företag) används, som använder en atomär magnetometer för att mäta provets magnetiska signal efter applicering av mekanisk kraft på de molekylära interaktionerna i provet. Här är de molekylära interaktionerna mellan DNA-linjalmolekylerna och mRNA i ribosom komplexet. Kraften ökas stegvis genom att öka centrifugalhastigheten. Efter applicering av varje kraft översätter motorn provet till Atom sensorn och flyttar sedan tillbaka. Därför erhålls två magnetiska fält profiler, en under framåtskanningen och den andra vid bakåtsökning13. Vi använder bara den senare för att extrahera topphöjden på grund av dess bättre signal-brus-förhållande. Topphöjden i ström (nA) konverteras till magnetisk signalamplitud (pT) baserad på kalibrerings kvadratvågen. - Varje mätning varar ca 5 min. När motorn kommer tillbaka till 0, klicka på Spara på frontpanelen. Använd försiktigt pincett för att ta prover från motor och centrifugera. Använd initial hastighet motsvarande 335,4 × g (2000 rpm, varv per minut för den centrifug som anges i material tabellen).
- Utbyta de två proverna och tillämpa en starkare kraft genom att öka centrifugalhastigheten med 100 rpm eller liknande steg storlek. Processen växelvis för att successivt öka kraften; ett komplett kraftspektrum erhålls efter 10-12 datapunkter.
- Använd pincett för att lasta provet på motorn. Klicka på Lås på frontpanelen för att köra programmet. Under tiden, Använd pincett för att ladda det andra provet i hållaren och placera det i centrifugen. Observera att den belagda glas sidan ska vara vänd mot mitten av centrifugen.
- Avsluta experimentet
- När alla planerade experiment är klara stänger du av utrustningen och fortsätter i motsatt ordning så som den var påslagen.
- Ta bort proverna från hållaren och sänk ned dem i etanol för rengöring och framtida användning. Rengör provhållaren med aceton vid kontaminering med magnet pärlor.
- Data analys
- Öppna python-analyscriptet och mata in alla experimentella data. Klicka på load Square för att mata in kvadratvågen som referens. Klicka sedan på Ladda baslinje för att mata in kvarvarande magnetisk signal som bakgrund.
- Definiera den totala magnetiska signalen minska som B0. Normalisera varje magnetisk signal minska b till b0 och uttrycka det som en procentsats. Rita den procentuella (B/B0) kontra centrifugalkraft för att få företagen spektrum.
Anmärkning: centrifugalkraften F beräknas från den flytande massan av de magnetiska pärlorna m (4,6 × 10− 15 kg), centrifugalhastigheten w och radien för centrifugen r (7,5 cm här) via ekvation F = mw 2 r. den typiska kraft upplösningen är 2-4 PN och kraft intervallet är 15-95 PN i detta arbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar detekterings schema och fotografier av huvudkomponenterna. Magnetisk detektering uppnås genom en atomär magnetometer med hjälp av skannings systemet (figur 1A)13. Provet placeras på en stång monterad på en linjär motor. Motorn transporterar provet till Atom sensorn inuti en magnetisk sköld, sedan tillbaka till den ursprungliga platsen för lossning. Atom magnetometern detekterar den magnetiska signalen under prov skanningen och producerar en signal spår, med den maximala signalen när provet är närmast sensorn. Figur 1 B visar fotot på det övergripande instrumentet. Figurerna 1c, D visar bilderna av magnetiseringsstationen och centrifugen som används för kraft applicering.
Principen för Dual DNA Ruler-analysen visas i figur 2. Ribosom komplexet är immobiliserat på ytan via 5 ' slutet av mRNA. Två DNA-linjaler är utformade för att söka den exakta positionen av ribosom, en för varje sida av mRNA. Den nuvarande immobilisering systemet gör 3 ' sidan lättillgänglig för sondera DNA-linjaler. Därför kan DNA-oligomerer som konjugeras med magnetiska pärlor bilda Duplexer med den upptäckta mRNA. Den 5 ' sidan är dock sterically hindras av ribosom och ytan. En länkare molekyl behövs alltså för att DNA ska nå den upptäckta mRNA på denna sida. Genom att variera länkaren längd, har vi fastställt att när länkaren är längre än 50 T, kan vi upptäcka en stark magnetisk signal som indikerar framgångsrik bildandet av DNA-mRNA duplex (figur 2B). Sambandet mellan dissociationskraft och duplex längd uppnås genom att variera antalet NT på DNA som kompletterar mRNA. Siffrorna 2C,D visar korrelationen för 3 '-respektive 5 '-sidorna. Eftersom den kraft skillnad mellan duplex av i följd längder är typiskt 12-20 pN och kraft upplösning är typiskt 2-4 pN, vi uppnår rutinmässigt Single-NT upplösning för längden på DNA-mRNA duplex baserat på deras dissociation styrkor.
Figur 3 visar resultaten av normala flyttning i frånvaro och förekomst av olika antibiotika. Flyttning är från MF-pre till MF-post (figur 3a). Den infälld indikerar att MF-pre bär ledig tRNAFmet och MF-tRNAPhe på P-och A-platser, respektive. MF-post transporterar tRNAFmet och MF-tRNAPhe på E-respektive P-platser, med en ledig a-plats. Figur 3 B visar att utan antibiotika, ribosom rör sig med 3 NT på båda sidor (rör sig mot 3 '-End). Detta är på grund av följande skäl: (i) DNA-mRNA duplex på 5 ' sidan uppvisar 12 BP och 15 BP bindande styrkor i MF-pre och MF-post, respektive. (II) duplex vid 3 '-änden uppvisar en omvänd förändring från 15 till 12 BP (figur 3C). Men när både Fusidinsyra och neomycin är närvarande, visar kraft spektra att ribosom rör sig endast med 1 NT vid 5 ' sidan men 2 NT vid 3 ' sidan (figur 3D, E). Detta resultat indikerar att ribosom transplacerad via en stegvis mekanism, vilket resulterar i en loopas mRNA konformation som har en extra NT inuti ribosom, som inte har experimentellt avslöjat förut. Detta är förenligt med rapporterad teoretisk simulering14. Alternativt kan riboen sträckas för att täcka 28 NT av mRNA, i stället för de vanliga 27 NT15. Efter tvättning bort antibiotika, normala flyttning inträffar, vilket framgår av 3 NT rörelser från både 5 ' och 3 ' sidor (lila spår i figur 3D, E). Den loopade konformation bildas inte när endast fusidinsyra används. Kraft spektra är förenliga med ribosrörelsen på 3 NT på båda sidor, liknande situationen för normal flyttning (figur 3F, G). Dual Ruler assay avslöjar också att viomycin helt hämmade translocation, som visas av 0 NT rörelse på båda sidor (figur 3H, I).
Vi har också undersökt om denna loopade konformation kan bildas på "-1" frameshifting motiv. Här sker transplaceringen av komplexen från MFNF-pre och MFNF-post på "U6A" motiv, som har befunnits vara en del av "-1" frameshifting motiv i hiv16. Figurerna 4a, B visar att i Mfnf-stolpen kortas DNA-mRNA duplex av antingen 2 eller 3 NT vid 3-änden; duplexlängden ökar med antingen 2 eller 3 NT vid 5-ändarna. Resultaten tyder på samexistens mellan både normal flyttning och "-1" frameshifting, med den tidigare korrelera med 3-NT rörelse och den senare korrelera med 2-NT rörelse. Dual Ruler-analysen kan tydligt lösa de två populationerna. Med både neomycin och Fusidinsyra, konstaterar vi att ribosom rör sig med 2 NT vid 3 '-slutet, men bara 1 NT vid 5 '-slutet, respektive (figur 4C, D). Därför, den loopas mRNA konformation äger också rum på hala sekvensen. När endast fusidinsyra är närvarande för mfnf-pre (figur 4E, F), är resultatet detsamma som för mfnf-post i panelerna A och B (blå spår), vilket indikerar att fusidinsyra ensamt inte är tillräckligt för att pausa flyttning eller frameshift. Därför bekräftar det att både Fusidinsyra och neomycin krävs för de olika förskjutningar för de två sidorna av mRNA.
Figur 1 : Instrument för den företag-baserade Dual DNA linjal assay. (A) Schematisk magnet detektering. 1: prov och dess fäste; 2: motor; 3: Atom sensor och magnetisk sköld. B) foto av atommagnetometern och prov hanteringssystemet. Siffrorna visar de faktiska motsvarande komponenterna som visas i schematiska. Observera magnetiska sköld är inne i pappkartong för förbättrad termisk stabilitet. (C) magnetiseringsstation. Dcentrifug som används för kraft användning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Dual Ruler assay med Single-NT upplösning för att studera ribosom translocation. (A) schematiskt av Dual Ruler-analysen, där två DNA-linjaler är konstruerade för respektive sond på 5-och 3-ändarna. Den röda linjen indikerar polyT-länkaren. (B) optimering av länkaren längd för linjal-i. (C) företag resultat för att bestämma dissociation styrkorna av duplexerna mellan linjal-ins och mRNA. Ddissociationstyrkor för duplexerna mellan linjal-outs och mRNA. Fel fältet definieras som förhållandet mellan instrumentets brus och den totala magnetiska signal minskningen (B0), med ett typiskt värde på ± 3-5%. Figur har reproducerats med tillstånd9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Sondera flyttning steg under påverkan av olika antibiotika. A) probing-system för KOMPLEXEN MF-pre och MF-post. Inset anger de schematiska ribosomerna i pre och post, som motsvarar de fasta och Dash-fodrade ovaler respektive. (B, C) FÖRETAG resultat utan antibiotika. (D, E) Resultat med både Fusidinsyra och neomycin. (F, G) Endast resultat med fusidinsyra. (H, I) Resultat med enbart viomycin. Vänster paneler: använda linjal-in för att sond på 5 ' sida; höger paneler: använda linjal-out för att sonden 3 ' sidan. Felstaplar beräknas på samma sätt som i föregående siffra. Figur har reproducerats med tillstånd9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Företag resultat av att använda dubbla linjaler för att sond frameshifting. (a, B) MFNF-pre och MFNF-post utan antibiotika. (C, D) Resultat med både Fusidinsyra och neomycin. (E, F) Resultat med endast fusidinsyra. Vänster paneler: använda linjal-in för att söka 5 ' sida; höger paneler: använda linjal-out för att söka 3 ' sidan. Felstaplar beräknas på samma sätt som i föregående siffra. Figur har reproducerats med tillstånd9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår Dual Ruler assay, de magnetiska pärlor spela två viktiga roller. Först fungerar de som kraftgivare eftersom centrifugalkraften är proportionell mot deras flytande massa. För det andra är pärlorna signal bärare upptäcks av en atomär magnetometer, som för närvarande är den mest exakta magnetiska sensorn. Att kombinera mekanisk manipulation och magnetisk detektering, är att företagen tekniken kan lösa ett stort antal molekylära interaktioner baserat på deras kritiska dissociation styrkor, som är grunden för DNA-linjalerna. Dual Ruler-analysen är unikt lämpad för att söka på båda sidor av mRNA under translocation. Eftersom det är en fysisk metod som endast förlitar sig på bildandet av Duplexes, är det inte begränsas av mRNA sidor eller andra biologiska begränsningar. Detta är en fördel jämfört med andra tekniker som bygger på biokemiska reaktioner. Vi har visat att genom att använda en lång Linker molekyl, kan linjalerna nå den riktade bindnings plats för att bestämma mRNA position. Specifikt för ribosom, är länkaren längd 50 T, vilket motsvarar 17 nm i längd. Denna längd är mycket nära storleken på ribosom17. Koncentrationerna av antibiotikummarna är typiska värderar från litteraturen. Det är också möjligt att använda vår metod för att avslöja uppkomsten värden för deras funktioner.
Det finns två kritiska aspekter för Dual Ruler-analysen. Den ena är den ömtåliga funktionaliserade ytan för molekylär immobilisering och efterföljande biologiska reaktioner. Varje lastning och tvättsteg bör utföras med minimal störning på ytan, så att molekylerna immobiliserade på ytan kommer att förbli intakt. För DNA-mRNA hybridisering process, tillräcklig tid är nödvändig för att säkerställa slutförandet av processen. Det rekommenderas också att använda Tam10 buffert med extra 1 M NaCl att upprätthålla en homeostatiska system. Den andra kritiska aspekten är magnetiseringen av pärlorna. Eftersom överdriven pärlor används, det finns gott om fria pärlor inte immobiliseras på ytan. Därför, när magnetisering provet, den belagda ytan bör närma sig och lämna magneten vertikalt. En mindre sväng av provet kan möjligen orsaka repor skador på ytan.
Vår Dual DNA linjal assay är för närvarande den enda metod som objektivt kan sond både ingången och utgångssidorna av mRNA i Ribosomen komplex med Single-NT upplösning. Ny mekanistisk information om ribosom translokalisering har erhållits. Metoden är allmänt tillämplig för molekylär förskjutning av nukleinsyror, som ofta påträffas i molekylärbiologi.
För framtida utveckling och tillämpningar, har vi visat att använda akustisk strålning kraft för att ersätta centrifugalkraften kommer att ytterligare förbättra kraft upplösning, nå sub-NT regim18. Vi undersöker också multiplexerade detektering med atomiska magnetometrar för att förbättra detekterings effektiviteten. Med dessa förbättringar förväntar vi oss att vår metod som beskrivs i detta arbete kommer att hitta breda tillämpningar inom biologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga potentiella intressekonflikter rapporterades av författarna.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av US National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. bekräftar stöd från Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
