Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии
Summary
Мы описываем подход к надежно генерировать химерные антигенные рецепторы (CAR) Т-клеток и проверить их дифференциации и функции в пробирке и in vivo.
Abstract
Приемная иммунотерапия обещает лечение рака и инфекционных заболеваний. Мы описываем простой подход к преобразовыванию первичных т-клеток человека с химерным рецептором антигена (CAR) и расширить их потомство ex vivo. Мы включаем анализы для измерения экспрессии ЦАР, а также дифференциации, пролиферативной способности и цитолитической активности. Мы описываем анализы для измерения производства цитокинов эффектора и воспалительной секреции цитокинов в т-клеток CAR. Наш подход обеспечивает надежный и комплексный метод культуры Т-клеток CAR для доклинических моделей приемной иммунотерапии.
Introduction
Химерные рецепторы антигена (ЦАР) обеспечивают перспективный подход к перенаправлению Т-клеток против различных опухолевых антигенов. CARs синтетические рецепторы, которые связывают антиген цели. Хотя их точный состав является переменным, CARs обычно содержат 3 различных домена. Внеклеточный домен направляет привязку к целевому антигену и, как правило, состоит из одного фрагмента цепных антител, связанных с CAR через внеклеточный шарнир. Второй домен, обычно полученный из цепочки CD3 и комплекса Рецепторов Т-клеток (TCR), способствует активации Т-клеток после участия в CAR. Третий costimulatory домен включен для повышения функции Т-клеток, прививаемость, метаболизм, и настойчивость. Успех Т-клеточной терапии CAR в различных гематопоитических злокачественных новообразований, включая B-клеток острого лимфобластного лейкоза (ВСЕ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) и множественной миеломы подчеркивает терапевтическое обещание этого подхода1,2,3,4,5,6. Недавнее Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами (FDA) утверждения для двух CD19 конкретных CAR T клеточной терапии, tisagenlecleucel для педиатрических и молодых взрослых ВСЕ и axicabtagene ciloleucel для диффузной большой B-клеточной лимфомы, усиливает перевод по заслугам CAR T клеточной терапии.
Подходы, основанные на Т, включают изоляцию Т-клеток от периферической крови, активацию, генетическую модификацию и расширение ex vivo. Дифференциация является важным параметром, регулирующим эффективность CAR Т-клеток. Соответственно, ограничение дифференциации Т-клеток во время культуры ex vivo повышает способность инфляции, расширения и упорства, обеспечивая долгосрочную иммунонадзор после приемной передачи2,7,9. Т-клетки состоят из нескольких различных подмножеств, включая: наивные Т-клетки (Tn), центральную память (Tcm), эм, эффектор дифференцированный (Tte) и память стволовых клеток (Tscm). Эффектор дифференцированных Т-клеток имеют мощные цитолитические способности; однако, они недолговечны и прививают плох10,11,12. В отличие от этого, Т-клетки с менее дифференцированным фенотипом, включая наивные Т-клетки и Ткм, обладают превосходными прививочными и пролиферативными способностями после передачи приемных клеток13,14,15,16,17,18. Состав собранных Т-клеток в предизготовленный продукт может варьироваться в разных пациентах и коррелирует с терапевтическим потенциалом Т-клеток CAR. Доля Т-клеток с наивным иммунофенотипом в стартовом аферезе сильно коррелирует как с прививкой, так и с клинической реакцией19.
Продолжительность культуры является важным параметром, влияющим на дифференциацию в Т-клетках CAR, подготовленных для приемной передачи. Недавно мы разработали подход к созданию высококачественных CAR T-клеток с использованием сокращенной парадигмы культуры20. Используя наш подход, мы показали, что ограниченная культура приводит к CAR Т-клеток с превосходной функцией эффектора и настойчивость после принятия передачи в ксенотрансплантата моделей лейкемии. Здесь мы представляем подходы к надежно генерировать CART19 клеток (автологические Т-клетки инженерии, чтобы выразить анти-CD19 scFv прилагается к CD3 и 4-1BB сигнализации доменов) и включают подробное описание анализов, которые обеспечивают понимание биоактивности CAR T и эффективность до принятия передачи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем подходы к измерению функции и эффективности CAR Т-клеток, собранных с разными интервалами всей культуры ex vivo. Наши методы обеспечивают всестороннее понимание анализов, предназначенных для оценки пролиферативной способности, а также функции эффектора in vitro. Мы описыва?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана частично за счет финансирования, предоставляемого Novartis Pharmaceuticals через исследовательский альянс с Университетом Пенсильвании (Майкл К. Милоне), а также Санкт-Болдрик Фонд Стипендиат премии (Саба Ghassemi).
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
