Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux
Summary
La méthode présentée combine l’analyse quantitative des ruptures à double brin d’ADN (DSB), de la distribution du cycle cellulaire et de l’apoptose pour permettre l’évaluation par cycle cellulaire de l’induction et de la réparation de l’ASD ainsi que les conséquences d’une défaillance de réparation.
Abstract
La méthode présentée ou les versions légèrement modifiées ont été conçues pour étudier les réponses spécifiques de traitement et les effets secondaires de divers traitements anticancéreux utilisés en oncologie clinique. Il permet une analyse quantitative et longitudinale de la réponse aux dommages à l’ADN après un stress génotoxique, induit par la radiothérapie et une multitude de médicaments anticancéreux. La méthode couvre toutes les étapes de la réponse aux dommages à l’ADN, fournissant des points de terminaison pour l’induction et la réparation des ruptures à double brin d’ADN (DSB), l’arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire par apoptose en cas de défaillance de réparation. La combinaison de ces mesures fournit des informations sur les effets du traitement dépendant du cycle cellulaire et permet ainsi une étude approfondie de l’interaction entre la prolifération cellulaire et les mécanismes d’adaptation contre les dommages à l’ADN. Comme l’effet de nombreux traitements contre le cancer, y compris les agents chimiothérapeutiques et le rayonnement ionisant, est limité ou varie fortement selon les phases spécifiques du cycle cellulaire, les analyses corrélatives reposent sur une méthode robuste et faisable pour évaluer les effets du traitement. sur l’ADN d’une manière spécifique au cycle cellulaire. Ce n’est pas possible avec des essais à extrémité unique et un avantage important de la méthode présentée. La méthode n’est pas limitée à une ligne cellulaire particulière et a été soigneusement testé dans une multitude de tumeurs et de lignées cellulaires tissulaires normales. Il peut être largement appliqué comme un test complet de génotoxicité dans de nombreux domaines de l’oncologie en plus de la radio-oncologie, y compris l’évaluation des facteurs de risque environnemental, le dépistage des médicaments et l’évaluation de l’instabilité génétique dans les cellules tumorales.
Introduction
Le but de l’oncologie est de tuer ou d’inactiver les cellules cancéreuses sans nuire aux cellules normales. De nombreuses thérapies induisent directement ou indirectement le stress génotoxique dans les cellules cancéreuses, mais aussi dans certaines d’autres qui s’étendent dans les cellules normales. La chimiothérapie ou les médicaments ciblés sont souvent combinés avec la radiothérapie pour améliorer la radiosensibilité de la tumeur irradiée1,2,3,4,5, ce qui permet une réduction de la dose de rayonnement pour minimiser les lésions normales des tissus.
Le rayonnement ionisant et d’autres agents génotoxiques induisent différents types de dommages à l’ADN, y compris les modifications de base, les liens croisés des brins et les ruptures à brin unique ou double. Les ruptures de double brin d’ADN (DSBs) sont les lésions d’ADN les plus sérieuses et leur induction est essentielle à l’effet de tueur de cellules du rayonnement ionisant et de divers drogues cytostatiques dans la radiochimiothérapie. Les DSB ne nuisent pas seulement à l’intégrité du génome, mais favorisent également la formation de mutations6,7. Par conséquent, différentes voies de réparation d’ESTB, et les mécanismes pour éliminer les cellules irrémédiablement endommagées comme l’apoptose se sont développées pendant l’évolution. L’ensemble de la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) est régulée par un réseau complexe de voies de signalisation qui atteignent de la reconnaissance des dommages à l’ADN et l’arrêt du cycle cellulaire pour permettre la réparation de l’ADN, à la mort cellulaire programmée ou l’inactivation en cas de défaillance de réparation8.
La méthode cytométrique présentée de flux a été développée pour étudier le DDR après le stress génotoxique dans un test complet qui couvre l’induction et la réparation d’ESTD, aussi bien que des conséquences de la rupture de réparation. Il combine la mesure du marqueur DSB largement appliqué H2AX avec l’analyse du cycle cellulaire et l’induction de l’apoptose, en utilisant l’analyse classique subG1 et une évaluation plus spécifique de l’activation de la caspase-3.
La combinaison de ces paramètres dans un seul analyse réduit non seulement le temps, la main-d’œuvre et les coûts, mais permet également la mesure du cycle cellulaire spécifique à l’induction et la réparation de l’ORD, ainsi que l’activation de la caspase-3. De telles analyses ne seraient pas possibles avec des essais effectués indépendamment, mais elles sont très pertinentes pour une compréhension complète de la réponse aux dommages à l’ADN après un stress génotoxique. Beaucoup de médicaments anticancéreux, tels que les composés cytostatiques, sont dirigés contre la division des cellules et leur efficacité dépend fortement du stade du cycle cellulaire. La disponibilité de différents processus de réparation DSB dépend également de l’étape de cycle cellulaire et le choix de voie qui est critique pour la précision de réparation, et détermine à son tour le sort de la cellule9,10,11, 12. En outre, la mesure spécifique au cycle cellulaire des niveaux d’ORD est plus précise que l’analyse mise en commun, parce que les niveaux d’ORD dépendent non seulement de la dose d’un composé génotoxique ou d’un rayonnement, mais aussi de la teneur en ADN de la cellule.
La méthode a été utilisée pour comparer l’efficacité de différentes radiothérapies pour surmonter les mécanismes de résistance dans le glioblastome13 et pour disséquer l’interaction entre le rayonnement ionisant et les médicaments ciblés dans l’ostéosarcome14,15 et les cancers tératoïdes rhabdoïdes atypiques16. En outre, la méthode décrite a été largement utilisée pour analyser les effets secondaires de la radio et de la chimiothérapie sur les cellules souches mésenchymales17,18,19,20,21, 22,23,24, qui sont essentiels pour la réparation des dommages normaux induits par le traitement de tissu et ont une application potentielle en médecine régénérative.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite est facile à utiliser et offre une mesure rapide, précise et reproductible de la réponse aux dommages à l’ADN, y compris l’induction et la réparation de la rupture à double brin (DSB), les effets du cycle cellulaire et la mort des cellules apoptotiques. La combinaison de ces points de terminaison fournit une image plus complète de leurs interrelations que les essais individuels. La méthode peut être largement appliquée comme un test complet de génotoxicité dans les domaines de la biologie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’équipe de l’installation de cytométrie de flux du Centre allemand de recherche sur le cancer (DKFZ) pour son soutien.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
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