מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות
Summary
טאו הוא חלבון עצבי מהווה הן בציטופלסמה, שם הוא נקשר microtubules, ובגרעין, שם הוא מפעיל פונקציות לא שגרתי כולל אפנון של הגנים הקשורים למחלות אלצהיימר. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את תפקידה של הטאו הגרעיני, תוך הימנעות כל הפרעות המגיעים cytoplasmic טאו.
Abstract
טאו הוא חלבון קשירה מיקרוטודורית המתבטאת הנוירונים הפונקציה הידועה העיקרית שלה קשורה לתחזוקה של יציבות ציטושלד. עם זאת, הראיות האחרונות הראו כי טאו נמצא גם בתאי subcellular אחרים כולל הגרעין שבו הוא מעורב הגנת ה-DNA, בתמלול rRNA, בניידות של retrotransposons ובארגון המבני של גרעינון. לאחרונה הוכיחו כי טאו גרעיני מעורב בביטוי של הגן VGluT1, מציע מנגנון מולקולרי שיכול להסביר את הגידול הפתולוגי של שחרור גלוטמט בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר. עד לאחרונה, מעורבות של הטאו הגרעיני ב מודולים את הביטוי של גנים היעד היה בטוח יחסית מעורפל בשל מגבלות טכניות שמנע את הדרה של תרומת cytoplasmic טאו או את ההשפעה של אחרים גורמים במורד הזרם. לא קשורים לטאו גרעיני כדי להתגבר על חוסר ודאות זה, פיתחנו שיטה ללמוד את הביטוי של גנים היעד במיוחד מאופנן על ידי חלבון הטאו הגרעיני. העסקנו בפרוטוקול שזוגות את השימוש באותות הלוקליזציה ובשבר הסלולר, דבר המאפשר להתיר את ההפרעה ממולקולות הטאו של הציטוטופלמיק. בעיקר, הפרוטוקול הוא קל והוא מורכב משיטות קלאסיות ואמינות החלות באופן כללי על מנת ללמוד את התפקוד הגרעיני של הטאו בסוגי תאים אחרים ובתנאים סלולריים.
Introduction
הפונקציות של החלבון טאו בגרעין צברה עניין משמעותי בשנים האחרונות, כפי שהוא הוכח להיות קשור הדוק עם חומצות גרעין1,2,3,4,5,6. אכן, הגנום לאחרונה מחקר רחב הראה כי טאו נקשר רצפי DNA הגניים הבין vivo7. תפקיד בארגון נוקלאוולאר הוצע8,9,10,11. יתר על כן, טאו הציע להיות מעורב הגנת דנ א מ חמצוני היפרתרמיה5,10,12,13, ואילו מוטציה טאו היה קשור לחוסר יציבות כרומוזום ו מאנולודיה14,15,16.
עד היום, האתגרים בלימוד התפקודים של הטאו בתוך התא הגרעיני נותרו כמעט בלתי פתורים בשל הקשיים בניתוח התרומה הספציפית של הטאו הגרעיני מתרומתה של cytoplasmic טאו. יתרה מזאת, הפונקציות המיוחסות למולקולות של הטאו בתוך התא הגרעיני, עד כה, הן רק משום שהן חסרות הדגמה חד משמעית של המעורבות הישירה של החלבונים הגרעיניים של הטאו. ואכן, מעורבות של הטאו בניידות של הרטרוטרנספסונים או בתמלול או ב-DNA הגנה11,12,17,18,19 יכול להיות גם הסביר על ידי תרומת cytoplasmic טאו או על ידי השפעה של גורמים אחרים במורד הזרם לא קשור לטאו גרעיני.
כאן, אנו מספקים שיטה שיכולה לפתור בעיה זו על ידי ניצול הליך קלאסי כדי לבודד את התא הגרעיני בשילוב עם השימוש של בונה הטאו 0N4R מתויג עם לוקליזציה גרעינית (NLS) או אותות היצוא הגרעיני (NES). גישה זו מבטלת את הסוגיות המורכבות הקשורות לחפצי האמנות האפשריים בשל הגלישה של מולקולות טאו מהתא cytoplasmic. יתר על כן, המבנים של טאו-NLS וטאו-נס מעניקים להעשרה או להדרה של מולקולות של הטאו מהתא הגרעיני, בהתאמה, מתן שליטה חיובית ושלילית למעורבות של מולקולות באוניברסיטת טאו גרעינית בפונקציה מסוימת. הפרוטוקול הוא מבחינה טכנית קל והוא מורכב שיטות קלאסיות ואמינות, כי הם החלים באופן כללי כדי ללמוד את הפונקציה הגרעינית של הטאו בסוגי תאים אחרים, הבדיל או לא, כמו תאים סרטניים להפעיל מחדש את הביטוי טאו20,21. יתר על כן, זה יכול להיות מיושם גם חלבונים אחרים הנמצאים הן הציטופלסמה ואת הגרעין על מנת לנתח פונקציות ביולוגיות הקשורות לתאים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים שיטה למדוד את ההשפעה של חלבון הטאו גרעיני על ביטוי גנים. עם הפרוטוקול הזה התרומה. של cytoplasmic טאו מוגבלת מאוד צעדים קריטיים של פרוטוקול זה הם הבאים: הבידול של האדם נוירובלסטומה SY5Y תאים, את השבר הסלולר ואת הלוקליזציה של חלבון הטאו בתא הגרעיני.
ראשון, כפי שמוצג בסעיף תו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של Scuola Normale הסופרור (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically – The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. 생화학. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer’s Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , (2012).
- Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?. Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
