रोग से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में ताऊ उपसेलुलर स्थानीयकरण का मॉड्यूलेशन
Summary
ताऊ एक न्यूरोनल प्रोटीन है जो साइटोप्लाज्म दोनों में मौजूद है, जहां यह माइक्रोट्यूबल को बांधता है, और नाभिक में, जहां यह अल्जाइमर रोग से संबंधित जीन के मॉड्यूलेशन सहित अपरंपरागत कार्य ों को डालती है। यहां, हम साइटोप्लाज्मिक ताऊ से आने वाले किसी भी हस्तक्षेप को छोड़कर परमाणु ताऊ के कार्य की जांच करने की विधि का वर्णन करते हैं ।
Abstract
ताऊ न्यूरॉन्स में व्यक्त एक माइक्रोट्यूबबुल बाध्यकारी प्रोटीन है और इसका मुख्य ज्ञात कार्य साइटोस्केलेटल स्थिरता के रखरखाव से संबंधित है। हालांकि, हाल के सबूतों से संकेत मिला है कि ताऊ नाभिक सहित अन्य उपकोशिकीय डिब्बों में भी मौजूद है जहां इसे डीएनए संरक्षण में, आरएनए प्रतिलेखन में, रेट्रोट्रांसपोसंस की गतिशीलता में और के संरचनात्मक संगठन में फंसाया जाता है नाभिक। हमने हाल ही में यह प्रदशत किया है कि परमाणु ताऊ VGluT1 जीन की अभिव्यक्ति में शामिल है, एक आणविक तंत्र का सुझाव है जो अल्जाइमर रोग के प्रारंभिक दौर में ग्लूटामेट रिलीज की रोग वृद्धि की व्याख्या कर सकता है । हाल ही में जब तक, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति मॉड्यूलिंग में परमाणु ताऊ की भागीदारी अपेक्षाकृत अनिश्चित और तकनीकी सीमाओं के कारण अस्पष्ट है कि साइटोप्लाज्मिक ताऊ के योगदान या अंय के प्रभाव के बहिष्कार को रोका गया है डाउनस्ट्रीम कारक परमाणु ताऊ से संबंधित नहीं हैं। इस अनिश्चितता को दूर करने के लिए, हमने विशेष रूप से परमाणु ताऊ प्रोटीन द्वारा संग्राहक लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक विधि विकसित की । हमने एक प्रोटोकॉल नियोजित किया जो स्थानीयकरण संकेतों और उप-कोशिकीय अंशता के उपयोग को जोड़ता है, जिससे साइटोप्लाज्मिक ताऊ अणुओं से हस्तक्षेप के बहिष्कार की अनुमति होती है। सबसे विशेष रूप से, प्रोटोकॉल आसान है और क्लासिक और विश्वसनीय तरीकों से बना है जो मोटे तौर पर अन्य सेल प्रकारों और सेलुलर स्थितियों में ताऊ के परमाणु कार्य का अध्ययन करने के लिए लागू होते हैं।
Introduction
नाभिक में ताऊ प्रोटीन के कार्यों ने हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण रुचि दिखाई है, क्योंकि इसे न्यूक्लिक एसिड1,2,3,4,5,6से निकटता से जुड़ा हुआ दिखाया गया है । दरअसल, हाल ही में जीनोम-वाइड अध्ययन से पता चला है कि ताऊ वीवो7में जेनिक और इंटरजेनिक डीएनए दृश्यों को बांधता है । न्यूक्लियोलर संगठन में8 ,9,10,11की भूमिकाकासुझाव दिया गया है . इसके अलावा ताऊ को ऑक्सीडेटिव और हाइपरथर्मिक स्ट्रेस5,10 ,12,13से डीएनए प्रोटेक्शन में शामिल करने का प्रस्ताव किया गया है, जबकि उत्परिवर्तित ताऊ को गुणसूत्र अस्थिरता और एन्यूप्लाइडी14,15,16से जोड़ा गया है ।
अब तक, परमाणु डिब्बे में ताऊ के कार्यों का अध्ययन करने में चुनौतियां साइटोप्लाज्मिक ताऊ के योगदान से परमाणु ताऊ के विशिष्ट योगदान को विच्छेदन करने में कठिनाइयों के कारण लगभग अनसुलझी रहीं । इसके अलावा, परमाणु डिब्बे में ताऊ अणुओं को जिम्मेदार ठहराया कार्य, अब तक, केवल सहसापेक्ष हैं क्योंकि उनके पास परमाणु ताऊ प्रोटीन की सीधी भागीदारी के स्पष्ट प्रदर्शन की कमी है । वास्तव में, रेट्रोट्रांसपोसंस की गतिशीलता में ताऊ की भागीदारी या rRNA प्रतिलेखन में या डीएनए संरक्षण में11,12,17,18,19 को साइटोप्लाज्मिक ताऊ के योगदान या परमाणु ताऊ से संबंधित अन्य डाउनस्ट्रीम कारकों के प्रभाव से भी समझाया जा सकता है ।
यहां, हम एक विधि प्रदान करते हैं जो परमाणु स्थानीयकरण (एनएलएस) या परमाणु निर्यात संकेतों (एनईएस) के साथ टैग किए गए 0N4R के उपयोग के साथ संयुक्त परमाणु डिब्बे को अलग करने के लिए एक शास्त्रीय प्रक्रिया का शोषण करके इस मुद्दे को हल कर सकती है। यह दृष्टिकोण साइटोप्लाज्मिक डिब्बे से ताऊ अणुओं के spillover के कारण संभावित कलाकृतियों से संबंधित जटिल मुद्दों को समाप्त करता है । इसके अलावा, ताऊ-एनएलएस और ताऊ-एनईएस का निर्माण परमाणु डिब्बे से ताऊ अणुओं के संवर्धन या बहिष्कार को क्रमशः प्रेरित करता है, जो एक विशिष्ट कार्य में परमाणु ताऊ अणुओं की भागीदारी के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता है । प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से आसान है और यह क्लासिक और विश्वसनीय तरीकों से बना है जो मोटे तौर पर अन्य सेल प्रकारों में ताऊ के परमाणु कार्य का अध्ययन करने के लिए लागू होते हैं, विभेदित या नहीं, जैसे कि कैंसर कोशिकाएं जो ताऊ अभिव्यक्ति20,21को फिर से सक्रिय करती हैं। इसके अलावा, इसे अन्य प्रोटीनों पर भी लागू किया जा सकता है जो विभिन्न डिब्बों से संबंधित जैविक कार्यों को विच्छेदन करने के लिए साइटोप्लाज्म और नाभिक दोनों में मौजूद हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम जीन अभिव्यक्ति पर परमाणु ताऊ प्रोटीन के प्रभाव को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं । इस प्रोटोकॉल के साथ साइटोप्लाज्मिक ताऊ का योगदान दृढ़ता से सीमित है। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम निम्नल…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्क्यूला नॉर्मल सुपीरियर (SNS14_B_DIPRIMIO) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; SNS16_B_DIPRIMIO) ।
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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