Tau är ett neuronala protein som finns både i cytoplasman, där det binder mikrotubuli, och i kärnan, där det utövar okonventionella funktioner, inklusive modulering av Alzheimers sjukdomsrelaterade gener. Här beskriver vi en metod för att undersöka funktionen av nukleära Tau samtidigt utesluta eventuella störningar som kommer från cytoplasmiska Tau.
Tau är en mikrotubuli bindande protein uttrycks i nervceller och dess viktigaste kända funktion är relaterad till upprätthållandet av cytoskelettets stabilitet. De senaste bevisen visade dock att Tau förekommer även i andra subcellulära fack, inklusive kärnan där den är inblandad i DNA-skydd, i rRNA-transkription, i rörligheten för retrotransposoner och i den strukturella organisationen av nucleolus. Vi har nyligen visat att Nuclear Tau är involverad i uttrycket av VGluT1 genen, vilket tyder på en molekylär mekanism som kan förklara den patologiska ökningen av glutamat release i de tidiga stadierna av Alzheimers sjukdom. Tills nyligen har inblandning av Nuclear Tau i modulerande uttrycket av målgener varit relativt osäker och tvetydig på grund av tekniska begränsningar som hindrade uteslutandet av bidraget av cytoplasmiska Tau eller effekten av andra nedströms faktorer som inte är relaterade till Nuclear Tau. För att övervinna denna osäkerhet utvecklade vi en metod för att studera uttrycket av målgener som specifikt modulerades av det nukleära Tau-proteinet. Vi använde ett protokoll som par användningen av lokaliseringssignaler och subcellulära fraktionering, vilket gör att utesluta störningar från cytoplasmiska Tau molekyler. Framför allt är protokollet lätt och består av klassiska och pålitliga metoder som i stor utsträckning är tillämpliga för att studera den nukleära funktionen av Tau i andra celltyper och cellulära förhållanden.
De funktioner tau protein i kärnan har samlat stort intresse under de senaste åren, eftersom det har visat sig vara nära förknippad med nukleinsyror1,2,3,4,5,6. I själva verket visade en nyligen genomomfattande studie att Tau binder genmodifierade och intergena DNA-sekvenser in vivo7. En roll i nukleolära organisation har föreslagits8,9,10,11. Tau har dessutom föreslagits att vara involverad i DNA-skydd mot oxidativ och Hypertermisk stress5,10,12,13, medan muterade Tau har kopplats till kromosom instabilitet och aneuploidi14,15,16.
Hittills har utmaningarna i att studera funktionerna i Tau i kärnkraft facket förblev nästan olösta på grund av svårigheterna att dissekera det specifika bidraget från Nuclear Tau från bidraget av cytoplasmiska Tau. Dessutom är de funktioner som tillskrivs Tau-molekyler i kärnkrafts facket, fram till nu, endast korrelära eftersom de saknar en entydig demonstration av direkt inblandning av nukleära Tau-proteiner. I själva verket kan Tau i rörligheten för retrotransposoner eller i rRNA transkription eller i DNA-skydd11,12,17,18,19 också förklaras av bidraget av cytoplasmiska Tau eller av effekten av andra nedströms faktorer som inte är relaterade till nukleär Tau.
Här ger vi en metod som kan lösa detta problem genom att utnyttja en klassisk procedur för att isolera kärnkrafts facket kombinerat med användning av Tau konstruktioner 0N4R märkta med nukleär lokalisering (NLS) eller kärnvapen export signaler (NES). Detta tillvägagångssätt eliminerar komplexa problem relaterade till möjliga artefakter på grund av spridnings av Tau molekyler från cytoplasmiska facket. Tau-NLS och Tau-NES-konstruktioner inducerar dessutom berikningen eller uteslutandet av Tau-molekyler från kärnkrafts facket, vilket ger positiva och negativa kontroller för inblandning av nukleära Tau-molekyler i en specifik funktion. Protokollet är tekniskt enkelt och består av klassiska och pålitliga metoder som i stor utsträckning är tillämpliga för att studera den nukleära funktionen i Tau i andra celltyper, differentierade eller inte, såsom cancerceller som reaktiverar Tau-uttrycket20,21. Dessutom kan det tillämpas även på andra proteiner som finns i både cytoplasman och kärnan för att dissekera biologiska funktioner relaterade till olika fack.
Vi beskriver en metod för att mäta effekten av nukleärt tau-protein på genuttryck. Med detta protokoll bidraget av cytoplasmiska Tau är starkt begränsad. Kritiska steg i detta protokoll är följande: differentieringen av humana neuroblastom sh-SY5Y-celler, den subcellulära fraktioneringen och lokaliseringen av tau-protein i kärnkrafts facket.
Först, som visas i representativa resultat avsnitt, differentiering av SH-SY5Y celler genom att lägga till RA och BDNF är avgörande för att…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Scuola normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |