Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas
Summary
Un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha adaptado al cribado de rendimiento semialto de inhibidores de la miosina de moléculas pequeñas. Este ensayo cinético se ejecuta en un formato de microplaca de 384 pocillos con volúmenes de reacción totales de sólo 20 s por poca. La plataforma debe ser aplicable a prácticamente cualquier enzima productora de ADP.
Abstract
Las enzimas ATPase utilizan la energía libre almacenada en el trifosfato de adenosina para catalizar una amplia variedad de procesos bioquímicos endergónicos in vivo que no ocurrirían espontáneamente. Estas proteínas son cruciales para esencialmente todos los aspectos de la vida celular, incluyendo el metabolismo, división celular, respuestas a los cambios ambientales y movimiento. El protocolo presentado aquí describe un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) que se ha adaptado a la detección de rendimiento semi-alto de inhibidores ATPase de moléculas pequeñas. El ensayo se ha aplicado a la miosina cardiaca y esquelética de miosina II, dos ATPases de motor molecular a base de actina, como prueba de principio. La hidrólisis de ATP se acopla a la oxidación de NADH por reacciones enzimáticas en el ensayo. En primer lugar, el ADP generado por el ATPase se regenera a ATP por piruvato quinasa (PK). PK cataliza la transición de fosfoenolpiruvato (PEP) al piruvato en paralelo. Posteriormente, el piruvato se reduce a lactato por lactato deshidrogenasa (LDH), que cataliza la oxidación de NADH en paralelo. Por lo tanto, la disminución de la concentración de ATP está directamente correlacionada con la disminución de la concentración de NADH, que es seguida por el cambio a la fluorescencia intrínseca de NADH. Mientras la PEP esté disponible en el sistema de reacción, la concentración de ADP sigue siendo muy baja, evitando la inhibición de la enzima ATPase por su propio producto. Además, la concentración de ATP se mantiene casi constante, produciendo cursos de tiempo lineales. La fluorescencia se monitorea continuamente, lo que permite una fácil estimación de la calidad de los datos y ayuda a filtrar los artefactos potenciales (por ejemplo, derivados de precipitaciones compuestas o cambios térmicos).
Introduction
Las miosinas son transductores de energía mecanoquímicos que hidrolizan trifosfato de adenosina (ATP) para generar movimientodireccional a lo largo de los filamentos del citoesqueleto de actina en eucariotas 1,2. Se han adaptado tanto estructural como cinéticamente a sus diversas funciones intracelulares, como el transporte deorgánulos, la contracción muscular o la generación de tensión citoesquelética 1,2. La superfamilia de miosina está representada por genes de miosina de 40 euros pertenecientes a 12 clases distintas de miosina en el genoma humano3,4. Los miembros de las clases de miosina desempeñan diversos papeles en un conjunto muy diverso de trastornos, como varios tipos de cáncer, trastornos neurológicos, miopatías esqueléticas y cardiomiopatía hipertrófica5,6. Dado el gran número de funciones fisiológicas y patológicas de estos motores moleculares, no es de extrañar que se estén volviendo cada vez más reconocidos como objetivos farmacológicos para una variedad de condiciones7. Recientemente se han realizado progresos significativos en el descubrimiento de nuevos inhibidores de la miosina8,9,10 y activadores11,y para mejorar las propiedades de los existentes12, 13 , 14 , 15.
El ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha utilizado durante mucho tiempo para medir la actividad ATPase de varias enzimas, como la bomba sarcoplasmática reticulum Ca2+ ATPase16, la reparación de ADN ATPase Rad5417, la AAA+ ATPase p9718 o la quinesina motora microtúbula19. El ensayo emplea un ciclo de regeneración ATP. El difosfato de adenosina (ADP) generado por la ATPase se regenera a ATP por piruvato quinasa (PK), que transforma una molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato en paralelo. Posteriormente, el piruvato se reduce a lactato por lactato deshidrogenasa (LDH). Eso, a su vez, oxida una molécula de NADH a NAD. Por lo tanto, la disminución en la concentración de NADH en función del tiempo es igual a la tasa de hidrólisis ATP. El ciclo de regeneración de ATP mantiene la concentración de ATP casi constante y la concentración de ADP baja siempre y cuando PEP esté disponible. Esto da como resultado cursos de tiempo lineales, por lo que es fácil determinar las tasas de reacción inicial y ayuda a evitar la inhibición del producto por ADP19. Aunque el ensayo ATPase acoplado a NADH ya se ha adaptado a un formato de 96 pozos20,los altos volúmenes de reacción (-150 l) lo hacen relativamente caro debido a la alta demanda de reactivos, lo que lo hace menos apto para un cribado rápido de grandes Compuestos. Los métodos alternativos, como el ensayo verde de malaquita19,21, que se basa en la detección del fosfato producido por la enzima ATPase, se demostraron más adecuados para la miniaturización y el cribado de alto rendimiento22 , 23 , 24. Sin embargo, es más probable que un ensayo de punto final se vea afectado por varios artefactos (que se describen a continuación), que pueden permanecer sin descubrir se descubierta en ausencia de cursos de tiempo completo.
Aquí, el ensayo ATPase acoplado a NADH se ha optimizado para la detección de rendimiento semi-alto de inhibidores de moléculas pequeñas. La miosina muscular esquelética y cardíaca II y los inhibidores de la miosina blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 y para-nitroblebbistatin12 se utilizan para demostrar el poder del ensayo, que se basa en NADH fluorescencia como una lectura. Este protocolo es susceptible de cribado de proyectos centrados en cualquier enzima que produzca ADP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos en el protocolo
Optimice el diseño de la placa ejecutando varias placas con control negativo solamente (reacción ATPase sin inhibidor). Inspeccione los resultados cuidadosamente en busca de patrones en las tasas de reacción. Por ejemplo, estos pueden surgir de efectos de borde y / o imperfecciones en el recubrimiento de superficie hidrófila de placas “no vinculantes”. Si se observa un patrón, cambie el tipo de placa y/o el diseño de placa para minimizar l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas NS096833 (CAM).
Materials
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
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