فحص قائم علي بروتين الفلورية الخضراء المعززة لدراسة نمو العصب في الخلايا العصبية الاوليه
Summary
في هذا التقرير ، ونحن وصف بروتوكول بسيط لدراسة النمو العصبي في الخلايا العصبية القشرية الفئران الجنينية عن طريق المشاركة في الانتقال مع EGFP والبروتين من الفائدة.
Abstract
العصب العصبي هو حدث أساسي في تشكيل الدوائر العصبية اثناء تطوير الجهاز العصبي. تحدث الاضرار العصبية الشديدة والخلل الوظيفي المتشابك في مختلف الامراض العصبية والانحطاط المرتبط بالسن. ان التحقيق في أليات التي تنظم نمو العصب العصبي لن يؤدي فقط إلى إلقاء الضوء القيم علي العمليات التنموية للدماغ ولكن أيضا علي هذه الاضطرابات العصبية. ونظرا لكفاءة التحويل المنخفضة ، فانه من الصعب حاليا دراسة تاثير بروتين محدد علي نمو العصب العصبي في الخلايا العصبونات الاوليه. هنا ، ونحن وصف طريقه بسيطه للتحقيق في النمو العصبي من قبل المشتركة بين الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه مع EGFP والبروتين من الفائدة (POI). هذا الأسلوب يسمح بتحديد الخلايا العصبية المتحولة POI من خلال اشاره EGFP ، التالي يمكن تحديد تاثير البوي علي النمو العصبي بدقه. ويوفر هذا الفحص القائم علي EGFP نهجا ملائما للتحقيق في المسارات التي تنظم نمو العصب العصبي.
Introduction
العصبية ، بما في ذلك كل من محاور و dendrites ، هي الإسقاطات من الخلايا العصبية المشاركة في إنشاء الشبكات العصبية. ان النمو الديناميكي للعصب أمر ضروري لتطوير الأعصاب. ومع ذلك ، تظل أليات التنظيمية الاساسيه في الأسفل غير واضحة. علي وجه الخصوص ، وغالبا ما يلاحظ تلف العصب في مختلف الامراض العصبية وبعد إصابات الدماغ1. ولذلك ، فان التحقيق في ادوار الجزيئات المفترضة في مختلف المسارات التنظيمية لنمو العصب العصبي من شانه ان يحسن فهمنا للعملية. وعلاوة علي ذلك ، فانه قد تكشف عن أهداف علاجيه جديده لمختلف الاضطرابات العصبية. خطوط الخلايا العصبية هي نماذج قيمه لدراسة العمليات العصبية بما في ذلك العصب العصبي لأنها سهله للتلاعب و transfect2,3. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن حدوث انحراف جيني في بعض خطوط الخلايا الشائعة الاستخدام ، مما قد يؤدي إلى اختلافات في الاستجابات الفسيولوجية4. وعلاوة علي ذلك ، تم عرض التعبير البروتين التفاضلي بين خطوط الخلايا العصبية والخلايا العصبية الاوليه. علي سبيل المثال, PC12, خط الخلايا العصبية المستمدة من الغدة الكظرية الفئران التي تستخدم علي نطاق واسع لدراسة العصب العصبي2,3, لا تعبر عن مستقبلات nmda5. وعلاوة علي ذلك ، فقد اقترح ان انخفاض الاستجابة للخط العصبي العصبي الماوس خط عصبيه-2a إلى السموم العصبية بالمقارنة مع الخلايا العصبية الاوليه ويرجع ذلك إلى عدم التعبير عن مستقبلات غشاء معينه وقناات أيون6. لذلك ، الخلايا العصبية الاوليه هي نموذج أكثر من المرغوب فيه وتمثيليه للتحقيق في النمو العصبي. ومع ذلك ، فان استخدام الخلايا العصبية الاوليه يعوقه الكفاءة المنخفضة للتحويل7.
هنا ، ونحن وصف الطريقة التي تنطوي علي الانتقال المشترك للبروتين من الفائدة (POI) و EGFP إلى الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه. وتعمل EGFP كعلامة مورفولوجية لتحديد الخلايا العصبية المتحولة بنجاح وتسمح بقياس العصب. نحن التحقق من صحة هذه الطريقة باستخدام المركبات/الجزيئات التي تم الإبلاغ عنها لتعدل العصب العصبي. وعلاوة علي ذلك ، تم استخدام FE65 ، وهو بروتين محول الخلايا العصبية التي ثبت لتحفيز النمو العصبي ، لتوضيح هذا النهج8،9. هذا البروتوكول ينطوي علي (1) عزل الخلايا العصبية القشرية الاوليه من الجنينية اليوم 18 (E18) أجنه الفئران ، (2) المشترك بين الخلايا العصبية مع EGFP و POI (FE65 في هذه الدراسة) و (3) التصوير وتحليل الخلايا العصبية باستخدام معالجه الصور البرمجيات ImageJ مع البرنامج المساعد نيونونج10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ذكر من قبل ، وتستخدم علي نطاق واسع PC12 والمستنسخات لها لدراسة تمديد نيوريت لان لديهم كفاءه ممتازة ترانسكشن2،3. في المقابل ، الخلايا العصبية الاوليه لديها معدل التحويل منخفضه ، والتي هي عقبه رئيسيه لدراسة المنظمين العصب العصبي من قبل الانتقال7</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بأموال من مجلس المنح البحثية في هونغ كونغ ، وصندوق البحوث الصحية والطبية (هونغ كونغ) ، وخطه المنح المباشرة للمجلس ، وصندوق الهبات التابع للكلية المتحدة ، ومؤسسه تويلاتش الخيرية.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)–soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
