Summary
При этом, протокол для проведения испытаний Моррис воды лабиринт для оценки способности обучения и памяти болезни Альцгеймера модели мышей и оценить влияние ручной иглоукалывание для их лечения описано.
Abstract
Эксперимент Морриса (MWM) заставляет экспериментальных животных плавать и научиться находить платформу, спрятанную в воде. Он широко используется в научных исследованиях для оценки обучения и памяти животных. Из-за широкого использования теста MWM, визуальные экспериментальные протоколы имеют важное значение для исследователей. Данная рукопись использует последние исследования для введения протокола теста MWM. Болезнь Альцгеймера (AD) характеризуется прогрессирующей потерей памяти и когнитивных функций. Альтернативным и дополнительным методом лечения, используемого для АД, является ручная иглоукалывание (MA). Для оценки способности к обучению и памяти мышей модели АД был проведен тест MWM. Для оценки пространственного обучения и способности к памяти использовались видимые испытания платформы, пробная версия с скрытой платформы, пробная версия зонда и реверсная проба MWM. В испытании видимой платформы, скорость плавания и задержка избежания мышей в по-разному группах существенно не отличали. В скрытых испытаниях платформы и разворота группа AD показала длительную задержку побега. Задержка побега значительно снизилась после лечения МА. Низкое число кроссоверов платформы и доля времени в квадранте SW в пробе зонда увеличили после обработки MA (p qlt; 0.05 или p qlt; 0.01). Результаты испытаний MWM показывают, что MA может эффективно улучшить пространственное обучение и способности памяти мышей модели AD. Строгие экспериментальные операции обеспечили гарантию надежности результатов.
Introduction
В настоящее время эксперимент MWM стал наиболее широко используемым и стандартным поведенческим экспериментом для оценки пространственного обучения и памяти животных1. Первоначально он был разработан британским психологом Ричардом Г. Моррисом и постоянно совершенствуется. Многие преимущества, такие как минимальная подготовка, кросс-видовполезность, нечувствительность к различиям в весе тела, и повторное тестирование способность MWM сделать его лучшим методом для оценки когнитивных функций2. Болезнь Альцгеймера (AD) является одной из основных медицинских проблем, в первую очередь характеризуется снижением обработки памяти и когнитивных функций3. MWM является незаменимым экспериментальным средством для оценки способности к обучению и памяти животных модели АД и эффективности методов вмешательства. Эксперименты MWM, как правило, отнимают много времени (6-11 дней) и включают в себя множество переменных факторов4. Хотя есть много статей об экспериментах с водными лабиринтами, на практике исследователям не хватает согласованного протокола. Поэтому особенно важно интуитивно едкие и строгие протокольные процессы. Используя предыдущий эксперимент в качестве примера5,описаны все шаги MWM. Использование MWM, предыдущие исследования показали, что иглоукалывание может облегчить симптомы модели АД мышей5,6,7.
При этом, протокол MWM, используемый в недавнем исследовании5 описывается, чтобы обеспечить простой и видимый метод для исследователей для оценки пространственного обучения и памяти животных модели АД.
Protocol
Этот протокол был одобрен Комитетом по этике животных Пекинского университета китайской медицины, и он был в соответствии со всеми руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных Китая. В ходе экспериментальной процедуры не было случайной смерти, и в этом исследовании животных не нужно было усыпнуть.
1. Подготовка
- Купить 30 мужчин SAMP8 мышей и 10 мужчин SAMR1 мышей (возраст: 8 месяцев).
- Размещайте мышей индивидуально в отдельных вентиляционных клетках при температуре 24 градусов по Цельсию и 12 ч темного/светлого цикла.
- Кормите мышей стандартной диетой гранул доступны объявление libitum и обеспечить стерильную питьевую воду.
- Акклиматизировать всех мышей к окружающей среде в течение 5 дней до экспериментов.
2. Группировка животных
- Случайно разделить 30 SAMP8 мышей на три группы (n no 10/group): Группа АД, ручная группа иглоукалывание (MA) и медицина (M) группы.
- Используйте 10 мышей SAMR1 в качестве нормальной контрольной (N) группы6.
3. Введение таблеток гидрохлорида допезила
- Измельчите таблетку гидрохлорида допезила (5 мг/таблетка) и растворите ее в 50 мл дистиллированной воды.
- Доставить лекарство, подготовленное в шаге 3.1 в дозах 1 мг/кг для мышей с помощью перорального гаважа один раз в день8 в течение всего эксперимента, в том числе дни, когда лечение МА и MWM тесты выполняются.
4. Администрация ручной акупунктуры
- Обездвижить мышей группы MA в мешках мыши.
- Используйте одноразовые стерильные иглы иглоукалывания (0,25 мм х 13 мм) и нанесите плоский колючий метод MA на Байхуэй (GV20) и Yintang (GV29)5 к носу в течение 20 мин. Убедитесь, что глубина иглы составляет 0,2-0,3 см.
- Двунаправленно вертеть манипуляции в пределах 90 "со скоростью около 180 р / мин каждые 5 минут в течение 15 с каждый раз в течение всего эксперимента, в том числе дней, когда лечение MA и MWM испытания выполняются.
5. Тест MWM
ПРИМЕЧАНИЕ: На 24 ч после 15 дней подряд лечения, подвергите мышей в четырех группах к тесту MWM. Проведите испытание видимой платформы, испытание скрытой платформы, пробную версию зонда и реверсную пробу в порядке.
- Подготовьтесь к тесту MWM.
- Позиция устройства MWM и системы приобретения и обработки сигнала в экспериментальном зале, предназначенном для поддержания звукоизоляции.
- Поместите круглый белый бак (диаметр 90 см, высота 50 см) в окружении непрозрачной ткани в середине устройства MWM.
- Прикрепите видеокамеру к потолку устройства MWM и подключите ее к видеорегистратору с автоматизированной системой слежения для сбора данных.
- Разделите резервуар лабиринта воды поровну в 4 равных зоны используя 2 взаимно перпендикулярные линии, обозначенные север (N), юг (S), восток (E), и запад (W). Концептуально разделите бассейн на четыре квадранта одинакового размера (NE, NW, SW и SE).
- В пределах видимости мыши, место визуальные сигналы различных форм на стене каждого квадранта в качестве визуальных ссылок (например, квадраты, треугольники и круги).
ПРИМЕЧАНИЕ: Дистальные сигналы являются навигационными ориентирами животного для определения местоположения платформы. Поэтому не двигайте их во время теста. Позиция исследователя является потенциальным дистальным сигналом и может влиять на MWM. Таким образом, исследователь должен держаться подальше от поля мышей в ожидании животного для выполнения теста. - Заполните круговой бак водой на глубину 30 см и поддерживать на 22 и 2 кв с электрическим обогревателем.
- Сделать воду непрозрачной с около 150 г сухого молока.
- Выполните видимую пробную версию платформы.
- Поместите пластиковую круглую платформу (диаметр 9,5 см; высота 28 см) на 1 см над поверхностью воды в любой квадрант наугад.
- Положите черный флаг на платформе.
- Отпустите каждую мышь мягко в воду на уровне воды из одного из четырех стартовых мест, обращенных к стене бака. Не опускайте мышь в воду.
- Активируйте программу компьютерного слежения, как только мышь выпущена в воду.
- Дайте каждой мыши 60 с для поиска платформы. В конце каждого испытания поместите каждую мышь на платформу и позвольте ей оставаться на ней в течение 10-30 с.
- Наблюдайте за траекториями плавания мышей на компьютере, записывайте время мыши, чтобы найти платформу в качестве задержки побега, и проанализируйте скорость плавания.
- Высушите каждую мышь полотенцами и подогрейте ее электрическим обогревателем. Обязательно используйте соответствующий источник тепла, чтобы предотвратить перегрев животного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите каждую мышь в бассейн в каждом из четырех различных стартовых квадрантов в течение четырех испытаний, перемещая платформу в другое место с каждым последующим испытанием. Интервал между двумя испытаниями с помощью каждой мыши составляет 15–20 минут.
- Выполните испытание скрытой платформы/тест навигации.
- Поместите ту же платформу без флага в квадранте SE.
- Случайно поместите мышь в бассейн от каждого из четырех квадрантов (NE, NW, SW, N) перед стеной бассейна в течение четырех испытаний. Используйте временной интервал 15-20 мин между двумя испытаниями.
- Дайте каждой мыши 60 с для поиска скрытой платформы.
- Запишите задержку побега каждого испытания после того, как мышь поднимается на платформу для последующего анализа.
- Высушите каждую мышь полотенцами и подогрейте ее электрическим обогревателем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение испытания скрытой платформы со дня 2–6 дней. Если мышь не может найти платформу в 60 с, привести мышь, чтобы подняться на платформу и позволить ему оставаться там в течение 10-30 с в конце каждого испытания. Выполните четыре испытания/день для каждой мыши в течение 5 дней подряд, с платформой и визуальными сигналами в постоянных позициях.
- Выполните пробную версию зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Найдите каждую мышь в бассейне в новом стартовом положении, чтобы наблюдать способность пространственного исследования мыши.- Удалите платформу.
- Найдите каждую мышь, обращенную к стене бака в бассейне один раз за 60 с. Убедитесь, что местом начала является квадрант NW, который является самым дальним квадрантом от квадранта SE.
- Запишите расстояние плавания, скорость плавания и номер кроссовера платформы в лабиринте.
- Высушите каждую мышь полотенцами и обеспечьте тепло после суда.
- Выполните реверсную пробную версию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните реверсную пробную версию с 8–11 дней.- Расположите платформу в середине квадранта NW (вместо квадранта SE).
- Следуйте шагам 5.3.2 5.3.5, как описано в разделе суда скрытой платформы.
6. Статистический анализ
- Для выполнения статистического анализа используйте программное обеспечение для статистики (например, SPSS 20.0).
Representative Results
Диаграмма оси времени этого протокола отображается на рисунке 1.
Рисунок 1: Диаграмма оси времени протокола исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Ось времени показывает, что этот эксперимент длился в общей сложности 21 дней. Лечение было применено к мыши в течение всего эксперимента и MWM испытания начались после 15 дней лечения. Видимая платформа, скрытая платформа, зонд, и реверсные испытания были проведены в порядке.
Ранее опубликованные результаты Ding et al.5 представлены как типичные результаты MWM Рисунок 2.
Рисунок 2: Типичные результаты теста морриса в водного лабиринта (n No 10). (A) Изменения в задержке побега и скорости плавания крыс среди различных групп в видимой платформе суда. (B) Изменения в задержке побега крыс среди различных групп в скрытой платформе и разворотных испытаний. По сравнению с контрольной группой значения p-lt- sp 0.05 и qp qlt; 0,01. Символ означает p slt; 0.01 по сравнению с группой AD. (C) Изменения в номере кроссовера платформы и процент времени, проведенного крысами в северо-западном квадранте среди различных экспериментальных групп в пробе зонда. Показаны результаты видимой платформы, скрытой платформы и обратного испытания в каждой группе (n No 10, среднее sD). Эта цифра была изменена с Ding et al5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
На рисунке 2A показаны результаты испытания видимой платформы. Статистических различий в задержке побега или скорости плавания между группами в первый день МВМ не наблюдалось. На рисунке 2B показаны результаты скрытой платформы и реверсного испытания от дней 2к6 и дней 8–11. Задержка в побеге группы АД оставалась на высоком уровне в каждый день теста. Задержка побега других трех групп постепенно уменьшалась. Задержка в побеге от дней 3–6 и дней 8–11 была больше в группе АД, чем в контрольной группе (p qlt; 0.01). Прожекторамы мышей в группах MA и наркотиков были короче, чем у мышей в группе АД в дни 2–6 и 8–11 дней, соответственно (p qlt; 0.01). На рисунке 2С показаны результаты исследования. Число кроссоверов платформы мышей в группе AD было статистически ниже, чем в группе управления (p qlt; 0.01). Номер кроссовера в группе MA был выше, чем в группе AD (p qlt; 0.05). Доля времени, проведенного мышами в группе AD в квадранте SW, была значительно ниже, чем в контрольной группе (p qlt; 0.01). Доля времени, затрачиваемого в квадранте SW в группе MA, была выше, чем в группе AD (p qlt; 0.01).
Discussion
Хотя многие водные лабиринты, в том числе водном лабиринте Биль и лабиринт воды Цинциннати, были вокруг, по крайней мере столетие, только MWM широко используется для эффективной и объективной оценки пространственного обучения и памяти способности, поскольку она имеет много преимущества9. Несмотря на широкое использование MWM, процедура не всегда использовалась оптимально. Эксперименты MWM обычно занимают много времени и находятся под влиянием многих переменных факторов. Есть некоторые эффективные и надежные аспекты, которые помогают обнаружить изменения в пространственном обучении и памяти способности, которые должны быть приняты во внимание.
Было проведено четыре различных испытания MWM. Видимая пробная платформа была использована на дне 1 MWM. Если животные могли плавать непосредственно к платформе, он указал, что способность к плаванию и зрение животных были нормальными10. Otnass предложил, что видимая платформа суда должны быть проведены первые11. Результаты исследования видимой платформы в этом исследовании означали, что четыре группы начали на одном уровне обучения. Оттуда можно было бы начать последовательные эксперименты. Испытание скрытой платформы было использовано для оценки способности мышей приобретать способность к обучению и памяти. Испытание зонда было дирижировало на день 7, 24 h после конца пробы спрятанной платформы, для того чтобы определить рабочую память. Наконец, реверсное испытание было использовано для оценки рабочей памяти2. Изменения в четырех различных испытаниях MWM вместе показали, что модель AD мышей были низкие способности к обучению и памяти и что MA оказал положительное влияние на AD5.
Нет никаких специальных стандартов для размеров бассейна и платформы1. Бассейн диаметром 214 см используется в большинстве исследований MWM. Vorhees и Williams продемонстрировали что с идентичными протоколами, крысы учат более быстро в бассеине 122 см чем в бассее 210 см; крутой склон кривой обучения указывает на то, что 122-см диаметр бассейн очень легко для крыс, чтобы перейти12. В действующем протоколе, учитывая старость и слабый рост мышей АД, использовался бассейн диаметром 90 см и платформа диаметром 9,5 см. Результаты предварительных экспериментов показали, что мышам было труднее найти платформу в бассейне большего диаметра. Таким образом, тесты в больших пулах не представляют реальной разницы между группами. Экспериментальным животным было труднее найти платформу в большом бассейне с меньшей платформой4. Поэтому размер ы бассейна и платформы должен быть оптимизирован в предварительных экспериментах в соответствии с экспериментальными требованиями и состоянием опытных животных.
Вода при температуре от 20 до 24 градусов цельсия рекомендуется для выполнения теста MWM4. Пожилые экспериментальные животные плохо себя выполняют в холодной воде13,что указывает на явную возрастно-зависимую потерю терморегуляции14. В этом исследовании, термостат был помещен в нижней части бассейна для поддержания температуры воды на 20-24 градусов по Цельсию. Результаты исследования не показали существенной разницы в скорости плавания между четырьмя группами5.
MWM является мощным методом для оценки когнитивных функций и широко используется в исследованиях в настоящее время. Тем не менее, нет определенного, стандартного, последовательного оборудования для выполнения теста MWM, в том числе размеры пула и платформы15,16. Различные лаборатории имеют различные спецификации для MWM. Поэтому исследователи выбирают соответствующее экспериментальное устройство в соответствии с их индивидуальными экспериментальными требованиями, которые могут вызвать путаницу среди исследователей. Необходимы также предварительные эксперименты. Необходимо провести дополнительные исследования по основным экспериментам, таким как MWM. В настоящее время гибкость MWM как экспериментального инструмента заключается только в способности выбирать основные протоколы в соответствии с целью исследования. Таким образом, этот тест может быть применен для оценки когнитивных функций в большей глубине.
Disclosures
Авторы не заявляют о потенциальном конфликте интересов.
Acknowledgments
Huiling Тянь и Нин Дин являются со-первых авторов. Чжиган Ли и Цзин Цзян являются соавторами. Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (Грант No 81804178, 81473774 и 81503654). Протокол и результаты, описанные здесь происходит из статьи, "Вовлеченность ручной иглоукалывания регулирует поведение и мозговой кровотока в SAMP8 Мышь Модель болезни Альцгеймера" д-р Нин Дин и др.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5 (2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63 (2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49 (1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107 (2019).
