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신경과학

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Abstract

As sinapses são unidades funcionais altamente compartimentadas que operam independentemente umas nas outras. Na doença de Huntington (HD) e outras doenças neurodegenerativas, essa independência pode ser comprometida devido à falta de glutamato insuficiente e aos efeitos resultantes de derramamento e derramamento. A cobertura ascrótica alterada dos terminais pré-sinápticos e/ou espinhas dendríticas, bem como um tamanho reduzido de aglomerados transportadores de glutamato em locais de liberação de glutamato foram implicadas na patogênese de doenças que resultam em sintomas de diss/hiperciesia. No entanto, os mecanismos que levam à disfunção das sinapses glutamatergicas em HD não são bem compreendidos. Melhorando e aplicando imagens sinapses, obtivemos dados que lançaram uma nova luz sobre os mecanismos que impedem o início dos movimentos. Aqui, descrevemos os elementos principais de uma abordagem relativamente barata para alcançar uma resolução de sinapse única usando o novo sensor de glutamato ultrarrápido geneticamente codificado iGluu, óptica de campo largo, uma câmera CMOS (sCMOS) científica, um laser de 473 nm e um sistema de posicionamento a laser para avaliar o estado das sinapses corticostriatais em fatias agudas de idade saudável ou doente. Os transientes de glutamato foram construídos a partir de pixels únicos ou múltiplos para obter estimativas de i) liberação de glutamato com base na elevação máxima da concentração de glutamato [Glu] ao lado da zona ativa e ii) absorção de glutamato, como refletido na constante temporal de decaimento (TauD) do perissináptico [Glu]. As diferenças no tamanho do bouton de repouso e nos padrões contrastantes da plasticidade de curto prazo serviram como critérios para a identificação de terminais corticostriatais como pertencentes à via intratelencefálica (TI) ou ao tratado piramidal (PT). Usando esses métodos, descobrimos que em camundongos HD sintomáticos ~40% das sinapses corticostriatais do tipo PT apresentaram liberação suficiente de glutamato, sugerindo que essas sinapses poderiam estar em risco de dano excitotóxico. Os resultados sublinham a utilidade do TauD como um biomarcador de sinapses disfuncionais em camundongos de Huntington com um fenótipo hipocinético.

Introduction

O impacto relativo de cada terminal sináptico pertencente a uma “conexão unitária” (ou seja, a conexão entre 2 células nervosas) é tipicamente avaliado pela sua influência no segmento inicial do neurônio postynaptico1,2. Gravações somáticas e/ou dendríticas de neurônios postynapticos representam os mais comuns e, até agora, também os meios mais produtivos para esclarecer o processamento de informações uma perspectiva de cima para baixo ou vertical3,4,5. No entanto, a presença de astrócitos com seus territórios discretos e (em roedores) não sobrepostos pode contribuir para uma perspectiva horizontal baseada em mecanismos locais de troca de sinais, integração e sincronização em sítios sinápticos6,7,8,9,10.

Por se saber que a astroglia desempenha, em geral, um papel importante na patogênese da doença neurodegenerativa11,12 e, em particular, um papel na manutenção e plasticidade das sinapses glutamatergicas13,14,15,16, é concebível que as alterações no desempenho sináptico evoluam de acordo com o estado dos astrócitos na área alvo compartilhada de fibras afetivas com diversas fibras de origem. Para explorar melhor os mecanismos regulatórios locais derivados da meta/astroglia em saúde e doença, é necessário avaliar as sinapses individuais. A presente abordagem foi trabalhada para estimar a gama de indicadores funcionais de liberação e desembaraço do glutamato e definir critérios que possam ser utilizados para identificar sinapses disfuncionais (ou recuperadas) em áreas cerebrais mais intimamente relacionadas à iniciação do movimento (ou seja, em primeiro lugar no córtex motor e estriado dorsal).

O estriado não tem neurônios glutamatergicos intrínsecos. Portanto, é relativamente fácil identificar afrents glutamatergicos de origem extrastriatal. Este último se originou principalmente no tálamo medial e no córtex cerebral (ver17,18,19,20 para mais). As sinapses corticostriatais são formadas pelos axôntos de neurônios piramidais localizados em camadas corticais 2/3 e 5. Os respectivos axôonos formam conexões intratelêlicas bilaterais (TI) ou conexões ipsilaterais através de um sistema de fibras que constitui mais caudalmente o trato piramidal (PT). Foi ainda sugerido que os terminais do tipo TI e PT diferem em suas características de liberação e tamanho21,22. Em vista desses dados, pode-se também esperar algumas diferenças no manuseio do glutamato.

O estriado é a área cerebral mais afetada na doença de Huntington (HD)5. Hd humano é uma grave doença neurodegenerativa geneticamente herdada. O modelo de mouse Q175 oferece uma oportunidade para investigar a base celular da forma hipocinética-rígida do HD, um estado que tem muito em comum com o parkinsonismo. A partir de uma idade de cerca de 1 ano, os camundongos homozigos Q175 (HOM) apresentam sinais de hipocinenésia, como revelado pela medição do tempo gasto sem movimento em campo aberto23. Os presentes experimentos com camundongos heterozigos Q175 (HET) confirmaram os déficits motores anteriores observados em HOM e, além disso, mostraram que os déficits motores observados foram acompanhados por um nível reduzido da proteína aminoácido excitatória astrocítica 2 (EAAT2) nas proximidades dos terminais sinápticos corticostriatais24. Por conseguinte, foi hipótese de que um déficit na captação de glutamato ascrócitico poderia levar a disfunção ou mesmo perda de respectivas sinapses25,26.

Aqui, descrevemos uma nova abordagem que permite avaliar a liberação de glutamato sinapse única em relação à quantidade do neurotransmissor liberado. O novo sensor de glutamato iGluu foi expresso em neurônios piramidais corticostriatais. Foi desenvolvido por Katalin Török27 e representa uma modificação do sensor de alta afinidade, mas lento, iGluSnFR28. Ambos os sensores são derivados da proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP). Para características espectrais e cinéticas, consulte Helassa et al.27. Resumidamente, iGluu é um sensor de baixa afinidade com cinética de desativação rápida e, portanto, particularmente adequado para estudar a liberação de glutamato em terminais sinápticos liberadores de glutamato. A constante de tempo de dissociação de iGluu foi determinada em um dispositivo de fluxo parado, o que fez com que um Taufora do valor de 2,1 ms a 20 °C, mas 0,68 ms quando extrapolado a uma temperatura de 34 °C27. Os terminais colaterais schaffer únicos sondados a 34 °C com escaneamento a laser em espiral na região CA1 de culturas organotípicas hipocampais um microscópio de 2 fótons exibiram uma média de tempo constante de decomposição de 2,7 ms.

Protocol

Todo o trabalho foi realizado de acordo com a Diretiva 2010/63/UE da UE para experimentos com animais e foi registrado no Escritório de Proteção e Segurança Técnica de Berlim (G0233/14 e G0218/17). NOTA: Gravações do tipo selvagem Q175 (WT) e heterozigotes (HETs) podem ser realizadas em qualquer idade e sexo. Aqui estudamos homens e mulheres com idades entre 51 e 76 semanas. 1. Injeção do sensor de glutamato iGluu para expressão …

Representative Results

Identificação de dois tipos de varizes glutamatergicas corticostriataisOs aferentes de TI e PT originam-se na camada 2/3 e 5, respectivamente, e apresentam padrões diferenciais de ramificação e terminação no estriado ipsilateral e contralateral (somente terminais de TI). Ainda pouco se sabe sobre as propriedades da liberação de glutamato e liberação condições de ativação repetitivas observadas durante o início dos movimentos, mas é bem documentado que as respectivas varicosidades lib…

Discussion

Os experimentos dizem respeito a uma questão de interesse geral — a independência da sinapse e sua possível perda no curso da neurodegeneração, e descrevemos uma nova abordagem para identificar sinapses afetadas em fatias cerebrais agudas de camundongos idosos (>1 ano). Aproveitando as características cinéticas melhoradas do sensor de glutamato recém-introduzido iGluu os experimentos iluminam a relação entre liberação de glutamato sináptico e captação de uma forma que não foi possível antes….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo CHDI (A-12467), a Fundação Alemã de Pesquisa (Exc 257/1 e DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) e fundos de pesquisa intramuros do Charité. Agradecemos a K. Török, St. George’s, University of London, e N. Helassa, University of Liverpool, pelo iGluu plasmid e muitas discussões úteis. D. Betances e A. Schönherr prestaram excelente assistência técnica.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
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References

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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
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