Dit protocol gebruikt een commercieel beschikbare druk myograph systeem te voeren druk myograph testen op de Murine vagina en cervix. Met behulp van media met en zonder calcium werden de bijdragen van de gladde spiercellen (SMC) basale Toon en passieve extracellulaire matrix (ECM) geïsoleerd voor de organen onder geschatte fysiologische omstandigheden.
De vrouwelijke voortplantingsorganen, in het bijzonder de vagina en de cervix, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire componenten en een unieke extracellulaire matrix (ECM). Gladde spiercellen vertonen een contractiele functie binnen de vaginale en cervicale wanden. Afhankelijk van de biochemische omgeving en de mechanische uitzetting van de orgel wanden, veranderen de gladde spiercellen de contractiele omstandigheden. De bijdrage van de gladde spiercellen onder fysiologische voorwaarden bij aanvang is geclassificeerd als een basale Toon. Specifieker, een basale Toon is de baseline gedeeltelijke vernauwing van gladde spiercellen in de afwezigheid van hormonale en neurale stimulatie. Bovendien biedt de ECM structurele ondersteuning voor de orgel wanden en fungeert het als reservoir voor biochemische signalen. Deze biochemische aanwijzingen zijn van vitaal belang voor verschillende orgel functies, zoals het aanzetten tot groei en het handhaven van homeostase. De ECM van elk orgaan bestaat voornamelijk uit collageenvezels (meestal collageen types I, III en V), elastische vezels en glycosaminoglycans/proteoglycans. De samenstelling en organisatie van de ECM dicteren de mechanische eigenschappen van elk orgaan. Een verandering in de ECM-samenstelling kan leiden tot de ontwikkeling van reproductieve pathologieën, zoals verzakking van het bekken of vroegtijdige cervicale remodellering. Bovendien kunnen veranderingen in ECM-microstructuur en stijfheid de activiteit van de gladde spiercellen en het fenotype veranderen, wat resulteert in het verlies van de contractiele kracht.
In dit werk worden de gerapporteerde protocollen gebruikt om de basale Toon en passieve mechanische eigenschappen van de nonpregnant Murine vagina en baarmoederhals op 4-6 maanden oud in Estrus te beoordelen. De organen werden gemonteerd in een in de handel verkrijgbare druk myograph en zowel druk-diameter en kracht-lengte tests werden uitgevoerd. Voorbeeldgegevens en gegevensanalyse technieken voor de mechanische karakterisering van de voortplantingsorganen zijn opgenomen. Dergelijke informatie kan nuttig zijn voor het construeren van wiskundige modellen en het rationaal ontwerpen van therapeutische interventies voor gezondheids pathologieën van vrouwen.
De vaginale wand bestaat uit vier lagen, het epitheel, lamina propria, Muscularis en adventitia. Het epitheel bestaat voornamelijk uit epitheelcellen. De lamina propria heeft een grote hoeveelheid elastische en fibrillar collageenvezels. De Muscularis is ook samengesteld uit elastine en collageenvezels, maar heeft een toegenomen hoeveelheid gladde spiercellen. De adventitia bestaat uit Elastin, collageen en fibroblasten, zij het in gereduceerde concentraties in vergelijking met de voorgaande lagen. De gladde spiercellen zijn van belang voor biomechanisch gemotiveerde onderzoeksgroepen als ze een rol spelen in de contractiele aard van de organen. Als zodanig, kwantificeren van de gladde spier cel gebied breuk en organisatie is de sleutel tot het begrijpen van de mechanische functie. Eerdere onderzoeken suggereren dat de gladde spier inhoud binnen de vaginale wand voornamelijk wordt georganiseerd in de omtrek en lengteas. Histologische analyse suggereert dat de Fractie van de gladde spier gebied is ongeveer 35% voor zowel de proximale en distale delen van de muur1.
De baarmoederhals is een zeer collagene structuur, die tot voor kort werd gedacht te hebben minimale gladde spier celinhoud2,3. Recente studies, echter, hebben gesuggereerd dat gladde spiercellen kunnen een grotere overvloed en rol in de baarmoederhals4,5hebben. De baarmoederhals vertoont een gradiënt van gladde spiercellen. De interne OS bevat 50-60% gladde spiercellen waar de externe OS slechts 10% bevat. Muis studies, echter, verslag van de baarmoederhals worden samengesteld uit 10-15% gladde spiercellen en 85-90% vezelgebonden bindweefsel zonder vermelding van regionale verschillen6,7,8. Gezien het feit dat het muismodel verschilt van het frequent gemelde menselijk model, zijn verdere onderzoeken met betrekking tot de muis baarmoederhals nodig.
Het doel van dit protocol was om de mechanische eigenschappen van de Murine vagina en cervix te verhelmaken. Dit werd bereikt met behulp van een druk myograph-apparaat waarmee de beoordeling van mechanische eigenschappen in de omtrek en axiale richtingen tegelijkertijd met behoud van inheemse cel-matrix interacties en orgel geometrie. De organen werden gemonteerd op twee aangepaste canules en beveiligd met zijde 6-0 hechtingen. Druk-diameter tests werden uitgevoerd rond de geschatte fysiologische axiale stretch om te bepalen van de conformiteit en Tangent moduli9. Er werden tests van de kracht lengte uitgevoerd om het geschatte axiale rek te bevestigen en om ervoor te zorgen dat de mechanische eigenschappen in het fysiologische bereik werden gekwantificeerd. Het experimentele protocol werd uitgevoerd op de nonpregnant Murine vagina en baarmoederhals op 4-6 maanden oud in Estrus.
Het protocol is onderverdeeld in twee belangrijke mechanische test secties: basale Toon en passieve testen. Een basale Toon wordt gedefinieerd als de baseline gedeeltelijke vernauwing van gladde spiercellen, zelfs in de afwezigheid van externe lokale, hormonale en neurale stimulatie10. Deze Baseline contractiele aard van de vagina en baarmoederhals levert karakteristieke mechanische gedragingen die vervolgens worden gemeten door de druk myograph systeem. De passieve eigenschappen worden beoordeeld door het verwijderen van het intercellulaire calcium dat de baseline toestand van contractie handhaaft, resulterend in ontspanning van de gladde spiercellen. In de passieve toestand leveren collageen en elastinevezels de dominante bijdragen voor de mechanische eigenschappen van de organen.
Het model van de Murine wordt veelvuldig gebruikt om pathologieën in de reproductieve gezondheid van vrouwen te bestuderen. De muis biedt verschillende voordelen voor het kwantificeren van de evoluerende relaties tussen ECM en mechanische eigenschappen binnen het voortplantingssysteem11,12,13,14. Deze voordelen omvatten korte en goed gekarakteriseerde Oestrische cycli, relatief lage kosten, gemak van handling, en een relatief korte zwangerschaps tijd15. Bovendien is het genoom van laboratorium muizen goed in kaart gebracht en genetisch gemodificeerde muizen zijn waardevolle hulpmiddelen om mechanistische hypotheses16,17,18te testen.
In de handel verkrijgbare druk myograph systemen worden intensief gebruikt om de mechanische reacties van verschillende weefsels en organen te kwantificeren. Sommige opmerkelijke structuren geanalyseerd op de druk myograph systeem omvatten elastische slagaders19,20,21,22, aderen en weefsel engineered vasculaire grafts23,24, de slokdarm25, en de grote darmen26. De druk myograph-technologie maakt gelijktijdige beoordeling van eigenschappen in de axiale en omtrek richtingen mogelijk met behoud van de native Cell-ECM interacties en in vivo geometrie. Ondanks het uitgebreide gebruik van myograph systemen in zachte weefsel en orgel mechanica, een protocol met behulp van de druk myograph technologie was niet eerder ontwikkeld voor de vagina en cervix. Voorafgaand onderzoek naar de mechanische eigenschappen van de vagina en baarmoederhals werden beoordeeld uniaxially27,28. Deze organen ervaren echter multiaxiaal laden binnen het lichaam29,30, dus kwantificeren hun Biaxiale mechanische respons is belangrijk.
Bovendien, recent werk suggereert dat gladde spiercellen een mogelijke rol kunnen spelen bij pathologieën van weke delen5,28,31,32. Dit biedt een andere aantrekkingskracht van het gebruik van de druk myograph technologie, als het behoudt de inheemse cel-matrix interacties, waardoor afbakening van de bijdrage die gladde spiercellen spelen in fysiologische en pathofysiologisch Voorwaarden. Hierin stellen we een protocol voor om de multiaxiale mechanische eigenschappen van de vagina en de baarmoederhals te kwantificeren onder zowel basale Toon als passieve omstandigheden.
Het protocol in dit artikel geeft een methode voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van de Murine vagina en cervix. De in dit protocol geanalyseerde mechanische eigenschappen omvatten zowel de passieve als de basale Toon omstandigheden van de organen. Passieve en basale Toon omstandigheden worden veroorzaakt door het veranderen van de biochemische omgeving waarin het orgel wordt ondergedompeld. Voor dit protocol bevat de bij de basale test betrokken media calcium. Testen van de basale Toon voorwaarde staat is…
The authors have nothing to disclose.
Het werk werd gefinancierd door de NSF CAREER Award subsidie #1751050.
2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |