Иммуногистохимический тест для обнаружения лиссавирусного антигена из формалин-фиксированных тканей
Summary
Здесь мы представляем протокол иммуногистохимического теста для обнаружения антигена вируса бешенства в качестве альтернативного диагностического теста для тканей, фиксированных формалином.
Abstract
Одним из основных диагностических методов борьбы с бешенством является обнаружение вирусного рибонуклеопротеинового (RNP) комплекса (антигена) в инфицированных образцах тканей. В то время как тест на прямые флуоресцентные антитела (DFA) или прямой экспресс-иммуногистохимический тест (DRIT) чаще всего используются для обнаружения антигена, оба теста требуют свежих и / или замороженных тканей для отпечатков на слайдах до обнаружения антигена с использованием антител. Если образцы собраны и зафиксированы в формалине, ни один из тестов не является оптимальным для обнаружения антигена, однако тестирование может быть выполнено с помощью обычной иммуногистохимии (IHC) после встраивания в парафиновые блоки и секционирования. При этом методе IHC ткани окрашивают антирабильскими антителами, срезы депарафинизируют, антиген извлекают частичным протеолизом или другими методами и инкубируют с первичными и вторичными антителами. Антигены окрашивают пероксидазой хрена/аминоэтилкарбазолом и контрапятнистами гематоксилином для визуализации с помощью светового микроскопа. В дополнение к обнаружению специфического антигена, фиксация формалина предлагает другие преимущества, такие как определение гистологических изменений, расслабленные условия хранения и транспортировки образцов (при температуре окружающей среды), возможность тестирования ретроспективных случаев и повышение биологической безопасности за счет инактивации инфекционных агентов.
Introduction
Бешенство – острый прогрессирующий энцефалит, вызываемый отрицательным чувством РНК-вирусов, относящихся к роду lyssavirus1. Почти 99% всех человеческих смертей, вызванных инфекцией вирусом бешенства (RABV), типовым членом рода, передается собаками2. Диагностика бешенства подозреваемых животных основывается на обнаружении антигена (в первую очередь вируснокодируемого нуклеопротеина, N-белка) в комплексе с геномной РНК (рибонуклеопротеиновый комплекс, RNP) в ткани головного мозга3. Обнаружение антигена с помощью теста на прямые флуоресцентные антитела (DFA) считается золотым стандартом для диагностики бешенства4. Способ использует свежий или свежезамороженный материал мозга, сенсорное оттиск на слайде, фиксацию в ацетоне, окрашивание с использованием коммерчески доступного флуоресцентного изотиоцианата (FITC), меченого моноклональными или поликлональными антителами (mAbs/pAbs) и считываемого флуоресцентной микроскопией5. Тест DFA является быстрым, чувствительным и специфическим для обнаружения антигена бешенства в свежей ткани мозга. Недавно было продемонстрировано, что прямой экспресс-иммуногистохимический тест (DRIT), модифицированный метод иммуногистохимии (IHC), демонстрирует аналогичную чувствительность к DFA, но предлагает преимущество световой микроскопии для визуализации6. Хотя метод обнаружения, используемый в DRIT, аналогичен IHC, на начальном этапе используются свежие или замороженные ткани для создания сенсорных отпечатков образца с последующей фиксацией в формалине.
IHC является широко используемым методом для определения гистологических изменений и обнаружения белков с использованием специфических антител в формалин-фиксированных тканях, встроенных в парафиновые блоки. IHC является установленным альтернативным тестом для обнаружения антигена бешенства в тканевых секциях7. IHC был особенно использован для диагностики ретроспективных случаев, в течение которого проявились неврологические заболевания, для определения бремени бешенства8. Парафин-внедренные формалин-фиксированные ткани сохраняют белки для обнаружения даже через несколько лет при хранении при температуре окружающей среды9. Лечение формалином модифицирует белки путем сшивания и изменения боковых цепей аминокислот, что может привести к тому, что эпитопы больше не будут реагировать против антител10. В то время как тест IHC для обнаружения антигена бешенства включает либо mAbs, либо pAbs, последний является выгодным, поскольку можно обнаружить несколько эпитопов и расходящихся лиссавирусов11.
Стандартными этапами, участвующими в IHC, являются фиксация тканей формалином, встраивание в парафиновые блоки, сечение тканей, депарафинизация и гидратация, восстановление эпитопов, реактивность против первичных и вторичных антител и развитие с использованием хромогенных субстратов. В этой рукописи подробно описан протокол диагностики бешенства. Для обнаружения антигена бешенства используется сыворотка мыши, иммунизированная RABV (pAbs), полученная в Центрах США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) Атланты, штат Джорджия, в сочетании с биотинилированными антимышечные вторичными антителами. Биотинилированные АБС обнаруживаются добавлением комплекса стрептавидин-пероксидазы хрена (HRP) с последующим развитием цвета с аминоэтилкарбазоловым субстратом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за высокого уровня смертности от бешенства после появления симптомов диагностика подозреваемых животных на инфекцию RABV чрезвычайно важна для соответствующего постэкспозиционного профилактического лечения. Диагностика бешенства в первую очередь зависит от методов DFA, DRIT и ПЦР с и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим лаборантов, эпидемиологов и филиалы департаментов общественного здравоохранения за представление образцов в Центры по контролю и профилактике заболеваний. Выводы и заключения в этом докладе являются выводами авторов и не обязательно отражают официальную позицию Центров по контролю и профилактике заболеваний. Использование фирменных наименований и коммерческих источников предназначено только для идентификации и не подразумевает одобрения со стороны Центров по контролю и профилактике заболеваний.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
