Immunohistochemistry Test for Lyssavirus Antigen Detection fra Formalin-Fixed Tissues
Summary
Her præsenterer vi en immunohistochemistry testprotokol til påvisning af rabiesvirusantigen som en alternativ diagnostisk test for formalin-faste væv.
Abstract
En af de primære diagnostiske metoder for rabies er påvisning af viral ribonucleoprotein (RNP) kompleks (antigen) i de inficerede vævsprøver. Mens den direkte fluorescerende antistof (DFA) test eller direkte hurtig immunohistokemisk test (DRIT) er mest almindeligt anvendt til antigen påvisning, begge tests kræver friske og / eller frosne væv for indtryk på dias før antigen detektion ved hjælp af antistoffer. Hvis prøverne indsamles og fikses i formalin, er ingen af testene optimale til antigendetektering, men test kan udføres af konventionel immunhistochemistry (IHC) efter indlejring i paraffinblokke og afsnit. Med denne IHC-metode farves væv med anti-rabies antistoffer, sektioner er deparaffinerede, antigen hentet ved delvis proteolyse eller andre metoder og inkuberes med primære og sekundære antistoffer. Antigener er plettet ved hjælp af peberrod peroxidase / amino ethyl carbazole og counterstained med hæmatoxylin til visualisering ved hjælp af et let mikroskop. Ud over den specifikke antigendetektering giver formalinfikation andre fordele som bestemmelse af histologiske ændringer, lempede betingelser for opbevaring og transport af prøver (under omgivelsestemperaturer), evne til at teste retrospektive tilfælde og forbedret biologisk sikkerhed gennem inaktivering af infektiøse agenser.
Introduction
Rabies er en akut progressiv encephalitis forårsaget af den negative følelse RNA-vira, der tilhører slægten lyssavirus1. Næsten 99% af alle dødsfald hos mennesker forårsaget af infektion med rabiesvirus (RABV), typen medlem af slægten, overføres af hunde2. Rabies diagnose af mistænkte dyr er afhængig af påvisning af antigen (primært viral kodet nukleoprotein, N protein) i kompleks med genomisk RNA (ribonucleoprotein kompleks, RNP) ihjernevævet 3. Antigendetektering ved den direkte fluorescerende antistoftest (DFA) betragtes som guldstandarden forrabiesdiagnose 4. Metoden anvender frisk eller frisk frossen hjerne materiale, et touch indtryk på et dias, fiksering i acetone, farvning ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende isothiocyanat (FITC) mærket monoklonale eller polyklonale antistoffer (mAbs / pAbs) og læses af fluorescens mikroskopi5. DFA-testen er hurtig, følsom og specifik for påvisning af rabiesantigen i frisk hjernevæv. For nylig blev en direkte hurtig immunohistokemisk test (DRIT), modificeret immunohistochemistry (IHC) teknik, demonstreret for at udvise lignende følsomhed over for DFA, men giver fordelen ved lysmikroskopi til visualisering6. Mens detektionsmetoden, der anvendes i DRIT, ligner IHC, bruger det første trin frisk eller frossen væv til at generere berøringsindtryk af prøven efterfulgt af fiksering i formalin.
IHC er en meget anvendt teknik til at bestemme histologiske ændringer og påvisning af proteiner ved hjælp af specifikke antistoffer i formalin-faste væv indlejret i paraffin blokke. IHC er en etableret alternativ test for påvisning af rabiesantigen i vævsafsnit7. IHC er især blevet brugt til diagnosticering af retrospektive tilfælde, der udviste neurologiske sygdomme til at bestemme byrden af rabies8. Paraffin-indlejret formalinfast væv bevarer proteinerne til detektion, selv efter flere år, når de opbevares ved omgivelsestemperatur9. Formalin behandling ændrer proteiner ved at krydskælle og ændre aminosyre sidekæder, hvilket kan gøre epitoperne ikke længere reaktive mod antistoffer10. Mens IHC-testen for påvisning af rabiesantigen involverer enten mAbs eller pAbs, er sidstnævnte fordelagtig, da flere epitoper og divergerende lyssavirus kan påvises11.
De standardtrin, der er involveret i IHC, er formalinfiksering af væv, indlejring i paraffinblokke, opdeling af væv, deparaffinisering og hydrering, epitopgendannelse, reaktivitet mod primære og sekundære antistoffer og udvikling ved hjælp af kromogene substrater. Dette manuskript beskriver en detaljeret redegørelse for protokollen for rabiesdiagnose. For rabies antigen påvisning, mus serum immuniseret med RABV (pAbs) genereret på den amerikanske Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, i kombination med biotinylerede anti-mus sekundære antistoffer udnyttes. Biotinylerede Abs detekteres ved tilsætning af streptavidin-peberrod peroxidase (HRP) kompleks efterfulgt af farveudviklingen med amino-ethylcarbazol substrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af den høje dødelighed af rabies efter symptomdebut er diagnosen af mistænkte dyr for RABV-infektion yderst kritisk for en passende profylaktisk behandling efter eksponering. Rabiesdiagnose afhænger primært af DFA, DRIT og PCR-baserede teknikker ved hjælp af frisk eller frossen væv. Til test af formalinfast væv giver IHC-testen en alternativ metode til følsom og specifik påvisning af RABV-antigen. Mens væv fastgjort i formalin har proteiner stabiliseret på grund af modifikation af sidekæder som kry…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de laboralister, epidemiologer og datterselskaber med folkesundhed afdelinger for prøve indlæg til Centers for Disease Control og Forebyggelse. Resultaterne og konklusionerne i denne rapport er forfatternes og repræsenterer ikke nødvendigvis den officielle holdning hos Centers for Disease Control and Prevention. Brug af handelsnavne og kommercielle kilder er kun til identifikation og indebærer ikke godkendelse af Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
