Summary

ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

Published: October 26, 2021
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Summary

ここでは、ホルマリン固定組織の代替診断試験として狂犬病ウイルス抗原の検出のための免疫組織化学試験プロトコルを紹介する。

Abstract

狂犬病の主要な診断モダリティの1つは、感染した組織サンプル中のウイルス性リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体(抗原)の検出である。直接蛍光抗体(DFA)試験または直接迅速な免疫組織化学検査(DRIT)は、抗原検出のために最も一般的に利用されるが、両方のテストは、抗体を使用して抗原検出前のスライド上の印象のために新鮮な組織および/または凍結組織を必要とする。サンプルをホルマリンで収集して固定する場合、いずれの試験も抗原検出に最適ではないが、パラフィンブロックおよび切除に埋め込んだ後に、通常の免疫検査(IHC)によって試験を行うことができる。このIHC法により、組織は抗狂犬病抗体で染色され、切片は脱パラフィン化され、抗原は部分タンパク質分解または他の方法によって取り出され、一次および二次抗体と共にインキュベートされる。抗原は、ホサビペルオキシダーゼ/アミノエチルカルバゾールを用いて染色され、光顕微鏡を用いた可視化のためにヘマトキシリンでカウンター染色される。特異的抗原検出に加えて、ホルマリン固定は、組織学的変化の決定、標本の貯蔵および輸送のための緩和された状態(周囲温度下)、遡及症例をテストする能力、および感染性物質の不活性化による生物学的安全性の向上などの他の利点を提供する。

Introduction

狂犬病は、リサウイルス属に属するRNAウイルスの負の感覚によって引き起こされる急性進行性脳炎である。狂犬病ウイルス(RABV)による感染によって生じた全人類の死亡のほぼ99%は、属の型メンバーである、犬2によって伝染する。疑わしい動物の狂犬病診断は、脳組織3におけるゲノムRNA(リボヌクレオタンパク質複合体、RNP)と複合体中の抗原(主にウイルスコード型核タンパク質、Nタンパク質)の検出に依存する。直接蛍光抗体(DFA)検査による抗原検出は狂犬病診断4のゴールドスタンダードと考えられている。この方法は、新鮮または新鮮な凍結脳材料を利用して、スライド上のタッチ印象、アセトンでの固定、モノクローナルまたはポリクローナル抗体(mAbs/pAbs)と蛍光顕微鏡法5で読み取られる市販の蛍光イソチオシアネート(FITC)を用いて染色する。DFA試験は、新鮮な脳組織における狂犬病抗原検出に対して、迅速、感受性、および特異的である。最近、直接迅速な免疫構造化学検査(DRIT)、修飾免疫体化学(IHC)技術は、DFAと同様の感受性を示すことが実証されたが、可視化6のための光顕微鏡の利点を提供する。DRITで使用される検出方法は、IHCに似ていますが、最初のステップでは、新鮮な組織または凍結した組織を利用して、ホルマリンに固定されたサンプルのタッチインプレッションを生成します。

IHCは、パラフィンブロックに埋め込まれたホルマリン固定組織において、特定の抗体を用いて組織学的変化とタンパク質の検出を決定するために広く使用されている技術です。IHCは、組織切片7における狂犬病抗原検出のための確立された代替試験である。IHCは狂犬病の負担を決定するために神経疾患を呈した遡及症例の診断のために特に利用されてきたパラフィン埋め込まれたホルマリン固定組織は、周囲温度9で保存した数年後でも検出のためにタンパク質を保存する。ホルマリン処理はアミノ酸側鎖を架橋および改変することによってタンパク質を修飾し、エピトープが抗体10に対して反応しなくなる可能性がある。狂犬病抗原検出のためのIHC検査にはmAbsまたはpAbsのいずれかが含まれるが、後者は複数のエピトープおよび発散性リサウイルスが11を検出できるとして有利である。

IHCに関与する標準的なステップは、組織のホルマリン固定、パラフィンブロックへの埋め込み、組織の切開、脱パラフィン化と水和、エピトープ回収、一次および二次抗体に対する反応性、および発色基質を用いた開発である。この原稿は狂犬病診断の議定書の詳細な説明を記述する。狂犬病抗原検出のために、米国疾病管理予防センター(CDC)アトランタ(ジョージア州)で発生したRABV(pAbs)で免疫されたマウス血清を、ビオチン化抗マウス二次抗体と組み合わせて利用する。ビオチン化腹筋は、ストレプトアビジン・ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体の添加によって検出され、続いてアミノエチルカルバゾール基質を用いた色の発達が続く。

Protocol

IHCプロトコルはホルマリン固定組織で実施されたが、RABVが存在する場合は不活性化するが、適切なバイオセーフティプロトコルに適切に従うべきである。すべてのバイオセーフティ手順は、適切な個人用保護具(PPE)を着用する、および12に記載されているワクチン接種要件を含む、微生物学および生物医学研究所(BMBL)第5版(https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm)におけ?…

Representative Results

図2 は、テストされた異なる脳組織における陽性および陰性対照サンプルの代表的なIHC染色結果を示す。 図2A,D,G は200xで陽性サンプルを表し、 図2B、E、H はそれぞれ400倍の倍率に相当します。 図 2A-C は 脳幹に対応します。 ?…

Discussion

症状の発症後の狂犬病の死亡率が高いため、RABV感染の疑いのある動物の診断は、適切な暴露後予防治療にとって極めて重要です。狂犬病の診断は、主にDFA、DRIT、および新鮮な組織または凍結組織を使用したPCRベースの技術に依存します。ホルマリン固定組織の検査では、IHC試験はRABV抗原の敏感かつ特異的な検出のための代替方法を提供します。ホルマリンに固定された組織は、架橋のよう?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、疾病管理予防センターへのサンプル提出のために公衆衛生部門を持つ研究所、疫学者、および関連会社に感謝します。この報告書の調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも疾病管理予防センターの公式の立場を表すものではありません。商品名と商業ソースの使用は識別のためだけであり、疾病管理予防センターによる承認を意味するものではありません。

Materials

3% hydrogen peroxide Pharamacy brands Off the shelf 3% H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) Millipore Sigma A6926
Acetate Buffer pH 5.2 Poly Scientific R&D Corp. s140
Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered Fisher Scientific SF100-4 Certified
Cover slips Corning Fisher Scientific 12-553-471 24 X 50 mm
Ethanol 190 Proof Pharmco-AAPER 111000190
Ethanol 200 Proof Pharmco-AAPER 111000200
Gill's hematoxylin formulation #2 Fisher Scientific CS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit seracare 71-00-18 Mouse Primary Antibody 
ImmunoHistoMount Millipore Sigma i1161 Mounting media
N,N, Dimethyl formamide GR Fisher Scientific D119
Phosphate Buffered Saline  HyClone RR14440.01 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective Multiple vendors
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective Multiple vendors
Pronase Millipore Sigma 53702 Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water  Poly Scientific R&D Corp. s1887
Tissue-Tek Slide stain set Fisher Scientific 50-294-72
TWEEN-80  Millipore Sigma P1754
Xylene Fisher Scientific X3S-4 Histological Grade
Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope Multiple vendors

References

  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
  3. Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
  4. WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
  5. Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
  6. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  7. Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
  8. Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
  9. Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
  10. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  11. Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
  12. Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
  13. WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
  14. Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  15. Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
  16. WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
  17. Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
check_url/kr/60138?article_type=t

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Cite This Article
Niezgoda, M., Subbian Satheshkumar, P. Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues. J. Vis. Exp. (176), e60138, doi:10.3791/60138 (2021).

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