Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina.
Abstract
Uma das principais modalidades de diagnóstico para raiva é a detecção do complexo de ribonucleoproteína viral (RNP) nas amostras de tecido infectado. Embora o teste de anticorpos fluorescentes diretos (DFA) ou o teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT) sejam mais comumente utilizados para a detecção de antígenos, ambos os testes requerem tecidos frescos e/ou congelados para impressões em lâminas antes da detecção de antígenos usando anticorpos. Se as amostras forem coletadas e fixadas em formalina, nenhum dos testes é ideal para a detecção de antígenos, no entanto, os testes podem ser realizados pela imunohistoquímica convencional (IHC) após a incorporação em blocos de parafina e secção. Com este método IHC, os tecidos são manchados com anticorpos antirraiva, seções são desparafinadas, antígenos recuperados por proteólise parcial ou outros métodos, e incubados com anticorpos primários e secundários. Os antígenos são manchados usando peroxidase de rabanete / amino etil carbazole e contra-manchados com hematoxilina para a visualização usando um microscópio leve. Além da detecção específica de antígenos, a fixação de formalina oferece outras vantagens como a determinação de alterações histológicas, condições relaxadas para armazenamento e transporte de amostras (sob temperaturas ambientes), capacidade de testar casos retrospectivos e maior segurança biológica através da inativação de agentes infecciosos.
Introduction
A raiva é uma encefalite progressiva aguda causada pelo sentido negativo vírus RNA pertencentes ao gênero lyssavirus1. Quase 99% de todas as mortes humanas causadas pela infecção pelo vírus da raiva (RABV), o tipo de membro do gênero, é transmitida por cães2. O diagnóstico de raiva de animais suspeitos baseia-se na detecção de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viral, n proteína) em complexo com RNA genômico (complexo de ribonucleoproteína, RNP) no tecido cerebral3. A detecção de antígeno pelo teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico da raiva4. O método utiliza material cerebral congelado fresco ou fresco, uma impressão de toque em um slide, fixação em acetona, coloração usando isothionato fluorescente comercialmente disponível (FITC) rotulados anticorpos monoclonais ou policclonais (mAbs/pAbs) e lidos pela microscopia de fluorescência5. O teste de DFA é rápido, sensível e específico para detecção de antígeno de raiva em tecido cerebral fresco. Recentemente, foi demonstrado um teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT), a técnica de imunohistoquímica modificada (IHC), que apresentou sensibilidade semelhante à DFA, mas oferece a vantagem da microscopia leve para visualização6. Embora o método de detecção utilizado no DRIT seja semelhante ao IHC, a etapa inicial utiliza tecidos frescos ou congelados para gerar impressões de toque da amostra seguidas de fixação em formalina.
IHC é uma técnica amplamente utilizada para determinar alterações histológicas e detecção de proteínas usando anticorpos específicos em tecidos fixos de formalina embutidos em blocos de parafina. IHC é um teste alternativo estabelecido para a detecção de antígenos da raiva nas seções teciduais7. A IHC tem sido particularmente utilizada para o diagnóstico de casos retrospectivos que apresentaram doenças neurológicas para determinar a carga da raiva8. Tecidos fixos de formalina embutidos em parafina preservam as proteínas para a detecção mesmo após vários anos quando armazenados à temperatura ambiente9. O tratamento formalin modifica as proteínas ao intercruzar e alterar as cadeias laterais de aminoácidos, o que pode tornar os epítoes não mais reativos contra anticorpos10. Embora o teste de IHC para detecção de antígenos da raiva envolva mAbs ou pAbs, este último é vantajoso, pois múltiplos epítopos e lyssavírus divergentes podem ser detectados11.
As etapas padrão envolvidas no IHC são a fixação formalina de tecidos, incorporação em blocos de parafina, secção de tecidos, desparafinação e hidratação, recuperação de epítopes, reatividade contra anticorpos primários e secundários e o desenvolvimento usando substratos cromogênicos. Este manuscrito descreve um relato detalhado do protocolo para diagnóstico de raiva. Para detecção de antígeno da raiva, o soro de camundongos imunizado com RABV (pAbs) gerado nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC) Atlanta, Geórgia, em combinação com anticorpos secundários anti-camundongos biotinilados são utilizados. O Abs biotinilado é detectado pela adição do complexo de peroxidase de rabanete streptavidin-horseradish (HRP), seguido pelo desenvolvimento de cores com substrato de amino-etilcarbazol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido à alta taxa de letalidade da raiva após o início dos sintomas, o diagnóstico de animais suspeitos para infecção por RABV é extremamente crítico para um tratamento profilático pós-exposição adequado. O diagnóstico da raiva depende principalmente de técnicas baseadas em DFA, DRIT e PCR usando tecidos frescos ou congelados. Para testes de tecidos fixos de formalina, o teste IHC fornece um método alternativo para a detecção sensível e específica do antígeno RABV. Embora os tecidos fixados em formal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos laboratórios, epidemiologistas e afiliados às secretarias de saúde pública pelas submissões de amostras aos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. Os achados e conclusões deste relatório são dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. O uso de nomes comerciais e fontes comerciais são apenas para identificação e não implicam endosso pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
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