Dirigirse a los medicamentos a los macrófagos de peces cebra sellos larvarios mediante la inyección de liposomas con drogas
Summary
Aquí, describimos la síntesis de liposomas cargados de drogas y su microinyección en peces cebra larvales con el propósito de dirigir la administración de fármacos a células de linaje de macrófagos.
Abstract
Las larvas de pez cebra (Danio rerio) se han convertido en un modelo popular para investigar las interacciones huésped-patógeno y la contribución de las células inmunitarias innatas a la enfermedad inflamatoria debido a su sistema inmunitario innato funcionalmente conservado. También se utilizan ampliamente para examinar cómo las células inmunitarias innatas ayudan a guiar los procesos de desarrollo. Al aprovechar la transparencia óptica y la tractabilidad genética del pez cebra larvaria, estos estudios a menudo se centran en enfoques de imágenes en vivo para caracterizar funcionalmente a los macrófagos y neutrófilos marcados fluorescentemente dentro de los animales intactos. Debido a su diversa heterogeneidad funcional y a su papel en constante expansión en la patogénesis de la enfermedad, los macrófagos han recibido una atención significativa. Además de las manipulaciones genéticas, las intervenciones químicas se utilizan ahora de forma rutinaria para manipular y examinar el comportamiento de los macrófagos en el pez cebra larvario. La administración de estos medicamentos se limita típicamente a la orientación pasiva de drogas libres a través de la inmersión directa o microinyección. Estos enfoques se basan en la suposición de que cualquier cambio en el comportamiento de los macrófagos es el resultado de un efecto directo de la droga en los propios macrófagos, y no una consecuencia posterior de un efecto directo sobre otro tipo de célula. Aquí, presentamos nuestros protocolos para apuntar a medicamentos específicamente a los macrófagos de peces cebra larvarios mediante liposomas fluorescentes cargados de drogas por microinyección. Revelamos que los liposomas fluorescentes azules cargados con drogas modificados por poloxámero s 188 son fácilmente tomados por los macrófagos, y no por los neutrófilos. También proporcionamos evidencia de que los medicamentos entregados de esta manera pueden afectar la actividad de los macrófagos de una manera consistente con el mecanismo de acción de la droga. Esta técnica será de valor para los investigadores que deseen garantizar la orientación de fármacos a los macrófagos y cuando los fármacos son demasiado tóxicos para ser suministrados por métodos tradicionales como la inmersión.
Introduction
El sistema de fagocitos mononucleares proporciona una primera línea de defensa contra los patógenos invasores. Este sistema consiste en monocitos, células dendríticas derivadas de monocitos y macrófagos, que profanan activamente patógenos extraños, limitando así la propagación de patógenos. Además de estas funciones de efector fagocítico y microbicida, las células dendríticas y los macrófagos también son capaces de producir citoquinas y antígeno-presentación para activar el sistema inmune adaptativo1. De estas células, los macrófagos han recibido especial atención debido a su diversa heterogeneidad funcional y su implicación en múltiples enfermedades inflamatorias, desde la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas hasta el cáncer2,3,4,5,6,7. La plasticidad de los macrófagos y su capacidad para adaptarse funcionalmente a las necesidades de su entorno tisular requieren enfoques experimentales para observar e interrogar directamente estas células in vivo.
Los peces cebra larvaria son un organismo modelo ideal para estudiar la función y plasticidad de los macrófagos in vivo8. La transparencia óptica del pez cebra larval proporciona una ventana para observar directamente el comportamiento de los macrófagos, especialmente cuando se combina con líneas de reporterotransgénicos que marcan los macrófagos. La explotación del potencial de imagen en vivo y la tractabilidad experimental del pez cebra larval ha dado lugar a muchos conocimientos significativos sobre la función de los macrófagos que tienen relevancia directa para la enfermedad humana9,10,11,12,13,14,15. Muchos de estos estudios también han aprovechado la alta conservación de la actividad farmacológica en el pez cebra (un atributo que sustenta su uso como plataforma entera de descubrimiento de fármacos animales16,17,18), mediante la utilización de intervenciones químicas para manipular farmacológicamente la función de los macrófagos. Hasta la fecha, estos tratamientos farmacológicos se han suministrado en su mayoría ya sea a través de la inmersión, que requiere que el fármaco sea soluble en agua, o mediante la microinyección directa de fármaco libre(Figura 1A). Las limitaciones de estas estrategias de entrega pasiva incluyen efectos fuera del objetivo y toxicidad general que pueden impedir evaluar cualquier impacto en la función de los macrófagos. Además, al investigar los efectos farmacológicos en los macrófagos se desconoce si los fármacos están actuando sobre los propios macrófagos o a través de mecanismos más indirectos. Al realizar estudios de intervención química similares para investigar la función de los macrófagos, reconocimos que había una necesidad insatisfecha de desarrollar un método de administración económico y sencillo para dirigir fármacos específicamente a los macrófagos.
Los liposomas son vesículas bicapas microscópicas, biocompatibles y lipídicas que pueden encapsular proteínas, nucleótidos y carga de fármacos19. La estructura bicapa de lípidos unilamellar o multilamellar de liposomas forma un lumen interno acuoso donde se pueden incorporar fármacos solubles en agua, mientras que los fármacos hidrófobos se pueden integrar en las membranas lipídicas. Además, las propiedades fisicoquímicas de los liposomas, incluyendo el tamaño, la carga y las modificaciones de la superficie se pueden manipular para adaptar su orientación a células específicas20,21. Estas características de los liposomas los han convertido en un vehículo atractivo para suministrar drogas y mejorar la precisión de los regímenes de tratamiento actuales20. Como los liposomas son naturalmente fagocitos por macrófagos (una característica explotada por su uso rutinario en la entrega de clodronato específicamente a macrófagos para experimentos de ablación22), se presentan como una opción atractiva para la administración de fármacos específicos de macrófagos(Figura 1B).
Este protocolo describe la formulación de fármacos en liposomas fluorescentes azules recubiertos con el poloxámero de polímero hidrófilo 188, que forma una capa protectora en la superficie del liposomas y se ha demostrado que mejora la retención de fármacos y tiene una biocompatibilidad superior23. Poloxámero fue elegido para el recubrimiento superficial de liposomas como nuestra investigación anterior había demostrado que, en comparación con los liposomas modificados de polietilenglicol, liposomas modificados de poloxámero mostraron una mejor biocompatibilidad después de la inyección subcutánea de patas de rata y farmacocinética similar en conejos después de la perfusión intravenosa23. También se describen protocolos para su microinyección en peces cebra larvales e imágenes en vivo para evaluar su capacidad de selección de macrófagos y su localización en compartimentos intracelulares necesarios para la degradación de los liposomas y la administración de fármacos citoplasmáticos. Como prueba de concepto hemos utilizado previamente esta técnica para apuntar dos fármacos a los macrófagos para suprimir su activación en un modelo larvario de pez cebra de inflamación aguda de gota24. Esta técnica de administración de fármacos amplía el “kit de herramientas” químico disponible para los investigadores de peces cebra que desean garantizar la meta de los macrófagos de sus fármacos de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos proporcionado un protocolo detallado para formular liposomas cargados con fármacos para apuntar específicamente a los macrófagos en peces cebra larvales. Este método se puede utilizar para diseccionar el papel de los macrófagos en ciertos modelos de enfermedades garantizando la administración directa dirigida de medicamentos específicamente a los macrófagos. Además, se puede utilizar cuando la toxicidad general de los medicamentos limita su uso cuando se administra por rutas más convencionales, com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones otorgadas a C.J.H. (Consejo de Investigación de la Salud de Nueva Zelanda y Fondo Marsden, Royal Society of New Zealand) y Z.W. (Faculty Research Development Fund de la Universidad de Auckland). Los autores agradecen a Alhad Mahagaonkar por la gestión experta de las instalaciones de pez cebra, la Unidad de Investigación de Imágenes Biomédicas, la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Auckland por su ayuda con las imágenes confocales y Graham Lieschke por regalar la línea de reporteros Tg(mpeg1:EGFP).
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
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