Cibler les médicaments aux macrophages de poisson zèbre larvaire en injectant des liposomes chargés de drogues

Summary

Ici, nous décrivons la synthèse des liposomes drug-charged et de leur microinjection dans le poisson zèbre larvaire dans le but de cibler l’administration de drogue aux cellules de macrophage-lignée.

Abstract

Les larves de poisson zèbre (Danio rerio) sont devenues un modèle populaire pour étudier les interactions hôte-pathogène et la contribution des cellules immunitaires innées aux maladies inflammatoires en raison de leur système immunitaire inné fonctionnellement conservé. Ils sont également largement utilisés pour examiner comment les cellules immunitaires innées aident à guider les processus de développement. En tirant parti de la transparence optique et de la tractabilité génétique du poisson zèbre larvaire, ces études se concentrent souvent sur des approches d’imagerie vivante pour caractériser fonctionnellement les macrophages et les neutrophiles fluorescents marqués chez les animaux intacts. En raison de leur hétérogénéité fonctionnelle diverse et de leurs rôles sans cesse croissants dans la pathogénie de la maladie, les macrophages ont reçu une attention considérable. En plus des manipulations génétiques, les interventions chimiques sont maintenant couramment utilisées pour manipuler et examiner le comportement des macrophages chez les poissons zèbres larvaires. L’administration de ces médicaments se limite généralement au ciblage passif de médicaments gratuits par immersion directe ou microinjection. Ces approches reposent sur l’hypothèse que tout changement au comportement de macrophage sont le résultat d’un effet direct du médicament sur les macrophages eux-mêmes, et non pas une conséquence en aval d’un effet direct sur un autre type de cellule. Ici, nous présentons nos protocoles pour cibler les médicaments spécifiquement aux macrophages de poissons zèbres larvaires en microinjectant des liposomes fluorescents chargés de médicaments. Nous révélons que les liposomes fluorescents bleus 188-modifiés de poloxamer-chargés de drogue sont facilement pris par des macrophages, et pas par des neutrophiles. Nous fournissons également la preuve que les médicaments livrés de cette façon peuvent avoir un impact sur l’activité des macrophages d’une manière compatible avec le mécanisme d’action du médicament. Cette technique sera utile aux chercheurs qui veulent assurer le ciblage des médicaments aux macrophages et lorsque les médicaments sont trop toxiques pour être livrés par des méthodes traditionnelles comme l’immersion.

Introduction

Le système de phagocytemono mononucléaire fournit une première ligne de défense contre les agents pathogènes envahissants. Ce système se compose de monocytes, de cellules dendritiques dérivées de monocytes et de macrophages, qui phagocytos activement les agents pathogènes étrangers, limitant ainsi la propagation des agents pathogènes. En plus de ces fonctions d’effectrice phagocytique et microbicides, les cellules dendritiques et les macrophages sont également capables de produire de la cytokine et de présenter des antigènes pour activer le système immunitaire adaptatif¹. Parmi ces cellules, les macrophages ont reçu une attention particulière en raison de leur hétérogénéité fonctionnelle diversifiée et de leur implication dans de multiples maladies inflammatoires, de l’auto-immunité et des maladies infectieuses au cancer^2,3,4,5,6,7. La plasticité des macrophages et leur capacité à s’adapter fonctionnellement aux besoins de leur environnement tissulaire nécessite des approches expérimentales pour observer et interroger directement ces cellules in vivo.

Le poisson zèbre larvaire est un organisme modèle idéal pour étudier la fonction et la plasticité des macrophages in vivo⁸. La transparence optique du poisson zèbre larvaire offre une fenêtre pour observer directement le comportement des macrophages, en particulier lorsqu’il est couplé avec des lignes de reporter transgéniques de marquage macrophage. Exploiter le potentiel d’imagerie en direct et la tractabilité expérimentale du poisson zèbre larvaire a conduit à de nombreuses idées significatives dans la fonction macrophage qui ont une pertinence directe à la maladie humaine^{9,10,11,12,13,14,15}. Bon nombre de ces études ont également profité de la forte conservation de l’activité des drogues chez le poisson zèbre (un attribut qui sous-tend leur utilisation comme une plate-forme de découverte de médicaments animaux^16,17,18), en utilisant des interventions chimiques pour manipuler pharmacologiquement la fonction macrophage. Jusqu’à présent, ces traitements pharmacologiques ont été pour la plupart administrés soit par immersion, ce qui exige que le médicament soit soluble dans l’eau, soit par microinjection directe de médicaments gratuits (Figure 1A). Les limites de ces stratégies d’administration passive comprennent des effets hors cible et une toxicité générale qui peuvent empêcher d’évaluer tout impact sur la fonction de macrophage. En outre, lors de l’étude des effets des drogues sur les macrophages, on ne sait pas si les médicaments agissent sur les macrophages eux-mêmes ou par des mécanismes plus indirects. Lors de l’exécution d’études d’intervention chimique similaires pour étudier la fonction de macrophage, nous avons reconnu qu’il y avait un besoin non satisfait de développer une méthode d’administration peu coûteuse et simple pour cibler les médicaments spécifiquement aux macrophages.

Les liposomes sont des vésicules bicouches microscopiques, biocompatibles et lipidiques qui peuvent encapsuler les protéines, les nucléotides et la cargaison de médicaments¹⁹. La structure bicouche lipidique unilamellar ou multilamellar des liposomes forme un lumen intérieur aqueux où les drogues solubles dans l’eau peuvent être incorporées tandis que les drogues hydrophobes peuvent être intégrées dans les membranes lipidiques. En outre, les propriétés physicochimiques des liposomes, y compris la taille, la charge et les modifications de surface peuvent être manipulées pour adapter leur ciblage à des cellules spécifiques^20,21. Ces caractéristiques des liposomes ont fait d’eux un véhicule attrayant pour livrer des médicaments et d’améliorer la précision des régimes de traitement actuels²⁰. Comme les liposomes sont naturellement phagocytozed par les macrophages (une caractéristique exploitée par leur utilisation courante dans la livraison de clodronate spécifiquement aux macrophages pour les expériences d’ablation²²), ils présentent comme une option attrayante pour l’administration de médicaments spécifiques aux macrophages (Figure 1B).

Ce protocole décrit la formulation des médicaments en liposomes fluorescents bleus recouverts du poloxamer 188 polymère hydrophile, qui forme une couche protectrice sur la surface liposome et a été montré pour augmenter la conservation de drogue et ont la biocompatibilité supérieure²³. Poloxamer a été choisi pour le revêtement de surface des liposomes comme notre recherche précédente avait montré que, par rapport aux liposomes modifiés de polyéthylène glycol, les liposomes modifiés de poloxamer ont montré une meilleure biocompatibilité suivant l’injection sous-cutanée des pattes de rat et pharmacocinétique semblable dans les lapins suivant l’infusion intraveineuse^23. Des protocoles sont également décrits pour leur microinjection dans le poisson zèbre larvaire et la formation image vivante pour évaluer leur capacité de ciblage de macrophage et la localisation aux compartiments intracellulaires nécessaires pour la dégradation de liposome et l’administration cytoplasmique de drogue. Comme preuve de concept, nous avons déjà utilisé cette technique pour cibler deux médicaments aux macrophages pour supprimer leur activation dans un modèle larvaire de poisson zèbre de l’inflammation goutte aigu²⁴. Cette technique d’administration de médicaments élargit la « boîte à outils » chimique à la disposition des chercheurs sur le poisson zèbre qui veulent assurer le ciblage des macrophages de leurs médicaments d’intérêt.

Protocol

1. Préparation de Liposomes à étiquette bleue Marina REMARQUE: Liposomes portant le colorant fluorescent bleu, Marina Blue et la drogue sont préparés en utilisant une méthode d’hydratation mince film avec l’insertion post de poloxamer 188. Toutes les procédures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Les liposomes de contrôle ne portent que Le bleu Marina et le PBS. L’exemple décrit ici le chargement de liposomes avec un médicament antioxydant mitoch…

Representative Results

L’approche d’hydratation des couches minces décrite ici pour la préparation de liposomes fluorescents enveloppant les médicaments est une méthode simple et rentable. Avec le protocole utilisé dans cette étude, les liposomes devraient être unilamellar23,24. La taille, le potentiel zeta, le chargement des médicaments et l’efficacité du piégeage des liposomes produits sont résumés dans le tableau 1. La taille des particules des lip…

Discussion

Ici, nous avons fourni un protocole détaillé pour formuler des liposomes chargés de médicaments pour cibler spécifiquement les macrophages chez les poissons zèbres larvaires. Cette méthode peut être utilisée pour disséquer le rôle des macrophages dans certains modèles de maladies en assurant l’administration ciblée directe de médicaments spécifiquement aux macrophages. En outre, il peut être utilisé lorsque la toxicité générale des médicaments limite leur utilisation lorsqu’ils sont livrés par d…

Materials

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes	GE Healthcare Life Sciences	110610
25 mL round-bottom flask	Sigma-Aldrich	Z278262
35 mm culture dish	Thermo Scientific	150460
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector	Agilent Technologies	G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump	Agilent Technologies	G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat	Agilent Technologies	G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles	Warner Instruments	203-776-0664
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Dumont No.5 fine tip forceps	Fine Science Tools	11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip	Eppendorf	5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels	Eppendorf	4053-6038
eyelash manipulator	Ted Pella Inc.	113
hemocytometer	Hawksley	BS.748
HEPES	BDH Chemicals	441474J
HPLC system	Agilent Technologies	1260 series HPLC system
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
low melting point agarose	Invitrogen	16520-100
LysoTracker Deep Red	Invitrogen	L12492	1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red	Thermo Scientific	L12492
magnetic stand	Narishige	GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)	Invitrogen	M12652	Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0387-500G
methylene blue	Alfa Aesar	42771
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-500G
micromanipulator	Narishige	M-152
mineral oil	Sigma-Aldrich	M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO	Sigma-Aldrich	SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator	Thermo Scientific	M36008
MitoTEMPO	Sigma-Aldrich	SML0737	Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-10G	Take care when handling, toxic.
NaCl	BDH Chemicals	27810.295
PBS (pH 7.4)	Gibco	10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm)	Corning Inc.	430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column	Phenomenex	00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate	Thermo Scientific	P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate	Invitrogen	P35361	Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette	Medi'Ray	RL200C
poloxamer 188	BASF Corporation
pressure injector	Applied Scientific Instruments	MPPI-2
rotary evaporator	Büchi, Flawil, Switzerland	Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope	Olympus	Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	75000090
stereomicroscope	Leica	MZ12
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040-25G	Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Ultrasonic bath	Thermo Scientific	FB-11205
Volocity Image Analysis Software	PerkinElmer	version 6.3
water bath
Zetasizer Nano	Malvern Instruments Ltd	Zetasizer Nano ZS ZEN 3600