Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması
Summary
Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.
Abstract
Hücre ortak kültür tahlilleri yaygın kanser de dahil olmak üzere hastalıkların biyolojisini daha iyi anlamak için farklı hücre tipleri arasındaki hücre-hücre etkileşimleri incelemek için kullanılmıştır. Ancak, geleneksel eş kültür sistemlerini kullanarak son derece heterojen hücre popülasyonlarında hücreler arası etkileşimlerin karmaşık mekanizmasını netleştirmek zordur, çünkü hücre alt popülasyonunun heterojenliği ortalama değerler tarafından gizlenmektedir; geleneksel ortak kültür sistemleri sadece nüfus sinyalini tanımlamak için kullanılabilir, ancak tek tek hücre davranışını izlemekten acizdir. Ayrıca, konvansiyonel tek hücreli deneysel yöntemler Poisson dağılımı nedeniyle hücre manipülasyonu düşük verimlilik var. Mikrofabrikasyon cihazlar tek hücreli çalışmalar için yeni gelişen bir teknolojidir, çünkü tek hücreleri yüksek iş seviyesinde doğru bir şekilde manipüle edebilirler ve numune ve reaktif tüketimini azaltabilirler. Burada, birden fazla tek hücreli ortak kültür için bir mikroakışkan çip in konseptini ve uygulamasını açıklıyoruz. Çip, bir kültür odasında birden fazla hücre türünü verimli bir şekilde yakalayabilir (%~46) ve tek hücre düzeyinde hücre-hücre etkileşimi altında hücrelerin davranışlarını (örneğin, göç, çoğalma, vb.) incelemek için yeterli bir kültür alanına sahiptir. Lenfatik endotel hücreleri ve oral skuamöz hücreli karsinom, çoklu tek hücreli etkileşim çalışmaları için mikroakışkan platformüzerinde tek hücreli ortak kültür deneyi yapmak için kullanıldı.
Introduction
Farklı tipte tek hücrelerin verimli bir şekilde yakalanması ve yeterli kültür alanı sağlanması, tek hücreli birden fazla hücre türünden oluşan tek hücre ortak kültür deneyleri için gereklidir1. Seyreltme sınırlandırılması, gerekli ekipman düşük maliyet nedeniyle, bu tür deneyler için tek hücreleri hazırlamak için en yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Ancak, Poisson dağıtım sınırlaması nedeniyle, maksimum tek hücre edinimi olasılığı sadece% 37, deneysel operasyon zahmetli ve zaman alıcı2yapma. Buna karşılık, floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak yüksek verimli tek hücreleri hazırlamak için Poisson dağıtım sınırlaması üstesinden gelebilir3. Ancak, facs pahalı enstrümantasyon ve bakım maliyeti nedeniyle bazı laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir. Mikrofabrikasyon cihazlar son zamanlarda tek hücreli yakalama için geliştirilmiştir4, tek hücre eşleştirme5, ve tek hücre kültürü uygulamaları. Bu aygıtlar, tekhücreleridoğru bir şekilde manipüle etme, yüksek işlem denemeleri yapma veya numune ve reaktif tüketimini azaltma yeteneklerine bağlı olarak avantajlıdır 6. Ancak, mevcut mikroakışkan cihazlar ile birden fazla hücre türleri ile tek hücreli co-kültür deneyleri gerçekleştirmek hala Poisson dağılımı1sınırlama nedeniyle zor ,7,8, veya yetersizlik tek hücre4,5,6,9,10ikiden fazla tür yakalamak için cihazlar .
Örneğin, Yoon ve ark. hücre-hücre etkileşimçalışması11için bir mikroakışkan cihaz bildirdi. Bu cihaz, hücreleri tek bir odadaki çiftleri eşleştirmek için olasılıksal yöntemi kullanır. Ancak, aygıt yapısındaki geometrik kısıtlamalar nedeniyle yalnızca iki farklı hücre türünün eşleşmesini sağlayabilir. Lee ve ark. başka bir rapor yakalamak ve tek hücreleri eşleştirmek için deterministik bir yöntem gösterdi12. Bu cihaz deterministik yöntemle eşleştirme verimliliğini artırır, ancak hücreleri eşleştirmek için gereken uzun çalışma süresi ile sınırlıdır. Özellikle, ikinci hücre yakalama sadece ilk yakalanan hücre yüzeye sonra 24 h. Zhao ve ark. tek bir hücre13iki tür yakalamak için bir damlacık tabanlı mikroakışkan cihaz rapor sonra yapılabilir. Damlacık bazlı mikroakışkan cihazın hala Poisson dağılımıile sınırlı olduğunu ve sadece bağlı olmayan hücrelerde kullanılabileceğini ve ekim işlemi sırasında kültür çözümünü değiştirmenin mümkün olmadığını bulduk.
Daha önce, kültür odasına tek hücreli birden fazla türde yakalamak için deterministik hidrodinamik kuvvetleri kullanan ve daha sonra analiz etmek için hücre ortak kültür deneyi gerçekleştirebilen bir mikroakışkan “hidrodinamik kapatma çipi” geliştirdik. hücre-hücre etkileşimleri altında tek tek hücre geçiş davranışı14. Hidrodinamik kapatma çipi, her biri serpantin by-pass kanalı, bir yakalama alanı ve bir kültür odası içeren dizili bir birim kümesinden oluşur. Serpantin by-pass kanalı ile kültür odası arasındaki akış direnci farkı ve özel olarak tasarlanmış bir işlem prosedürü kullanılarak, farklı tipte tek hücreler tekrar tekrar kültür odasına yakalanabilir. Özellikle, kültür odasının geniş alanı sadece hücre yakalama sırasında fışkıran hücre önlemek değil, aynı zamanda hücrelerin yayılması için yeterli alan sağlamak, çoğalmak ve göç, canlı tek hücreetkileşimleri gözlemlemek için izin. Bu makalede, bu cihazın üretimi ve ayrıntılı protokol adımları üzerinde duruluyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör mikroortamında çeşitli hücrelerin hücreler arası etkileşimleri tümörün ilerlemesinde önemli bir rol oynamaktadır17. Hücre-hücre etkileşimlerinin mekanizmasını anlamak için ortak bir analitik yöntem olarak ortak kültür sistemleri kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla hücre tipleri ve hücrelerin heterojenliği deneysel karmaşıklık ve analitik zorluklara yol açmıştır.
Hidrodinamik kapatma çipi, seyreltme yöntemi ve mikrokuyu platfo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (105-2628-E-400-001-MY2) ve Doku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Doktora Programı, Ulusal Chung Hsing Üniversitesi ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O’hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
