Établir des co-cultures à base de cellules uniques dans une manière déterministe avec une puce microfluidique
Summary
Ce rapport décrit une méthode microfluidique basée sur la puce pour mettre en place une expérience de culture cellulaire unique dans laquelle l’appariement à haut rendement et l’analyse microscopique de plusieurs cellules individuelles peuvent être atteints.
Abstract
Les tests de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier les interactions cellules-cellules entre les différents types de cellules afin de mieux comprendre la biologie des maladies, y compris le cancer. Cependant, il est difficile de clarifier le mécanisme complexe des interactions intercellulaires dans les populations cellulaires très hétérogènes en utilisant des systèmes de co-culture conventionnels parce que l’hétérogénéité de la sous-population cellulaire est obscurcie par les valeurs moyennes; les systèmes conventionnels de co-culture ne peuvent être utilisés que pour décrire le signal de la population, mais sont incapables de suivre le comportement des cellules individuelles. En outre, les méthodes expérimentales monocellulaires conventionnelles ont une faible efficacité dans la manipulation cellulaire en raison de la distribution de Poisson. Les dispositifs microfabriqués sont une technologie émergente pour les études unicellulaires, car ils peuvent manipuler avec précision les cellules individuelles à haut débit et peuvent réduire la consommation d’échantillons et de réactifs. Ici, nous décrivons le concept et l’application d’une puce microfluidique pour plusieurs co-cultures unicellulaires. La puce peut capturer efficacement plusieurs types de cellules individuelles dans une chambre de culture (46 %) et dispose d’un espace de culture suffisant utile pour étudier le comportement des cellules (p. ex. migration, prolifération, etc.) sous interaction cellule-cellule au niveau unicellulaire. Des cellules endothéliales lymphatiques et le carcinome squamous oral de cellules ont été employés pour effectuer une expérience de co-culture unicellulaire sur la plate-forme microfluidique pour des études multiples vivantes d’interaction unicellulaire.
Introduction
La capture efficace de différents types de cellules individuelles et la fourniture d’un espace de culture suffisant sont nécessaires pour les expériences de co-culture à cellule unique de plusieurs types de cellules individuelles1. Limiter la dilution est la méthode la plus couramment utilisée pour préparer les cellules individuelles pour de telles expériences, en raison du faible coût de l’équipement requis. Cependant, en raison de la limitation de distribution de Poisson, la probabilité maximale d’acquisition d’une seule cellule n’est que de 37 %, ce qui rend l’opération expérimentale laborieuse et longue2. En revanche, l’utilisation de la fluorescence activée tri des cellules (FACS) peut surmonter la limitation de distribution Poisson à haute efficacité préparer les cellules uniques3. Toutefois, les FACS peuvent ne pas être accessibles à certains laboratoires en raison des coûts d’instrumentation et d’entretien coûteux. Des dispositifs microfabriqués ont été récemment développés pour le piégeage à cellule unique4, l’appariement à cellule unique5, et les applications de culture monocellulaire. Ces dispositifs sont avantageux en fonction de leur capacité à manipuler avec précision les cellules individuelles6, effectuer des expériences à haut débit, ou de réduire la consommation d’échantillons et de réactifs. Cependant, l’exécution d’expériences de co-culture unicellulaires avec plusieurs types de cellules avec les dispositifs microfluidiques actuels est toujours difficile en raison de la limitation de la distribution Poisson1,7,8, ou l’incapacité de les dispositifs pour capturer plus de deux types de cellules simples4,5,6,9,10.
Par exemple, Yoon et coll. ont signalé un dispositif microfluidique pour l’étude d’interaction cellule-cellule11. Ce dispositif utilise la méthode probabiliste pour jumeler les cellules dans une chambre. Cependant, il ne peut atteindre l’appariement de deux types de cellules différents en raison de restrictions géométriques dans la structure de l’appareil. Un autre rapport de Lee et coll. a démontré une méthode déterministe pour capturer et jumeler les cellules individuelles12. Ce dispositif augmente l’efficacité d’appariement par la méthode déterministe mais il est limité par le temps de fonctionnement prolongé requis pour coupler des cellules. Plus précisément, la deuxième capture cellulaire ne peut être effectuée qu’après que la première cellule capturée a été fixée à la surface après 24 h. Zhao et coll. ont signalé un dispositif microfluidique à base de gouttelettes pour capturer deux types d’une seule cellule13. Nous pouvons trouver que le dispositif microfluidique à base de gouttelettes est encore limité à la distribution de Poisson et ne peut être utilisé que sur les cellules non attachées, et il n’est pas possible de changer la solution de culture pendant le processus de culture.
Auparavant, nous avons mis au point une « puce de fermeture hydrodynamique » microfluidique qui utilise des forces hydrodynamiques déterministes pour capturer plusieurs types de cellules individuelles dans la chambre de culture et peut par la suite effectuer une expérience de co-culture cellulaire pour analyser comportement de migration cellulaire individuel dans le cadre des interactions cellule-cellule14. La puce de fermeture hydrodynamique comprend un ensemble d’unités qui contiennent chacune un canal de contournement serpentin, un site de capture et une chambre de culture. En utilisant la différence de résistance au débit entre le canal de contournement serpentin et la chambre de culture, et une procédure d’opération spécialement conçue, différents types de cellules individuelles peuvent être capturés à plusieurs reprises dans la chambre de culture. Notamment, l’espace suffisant de la chambre de culture peut non seulement empêcher la cellule d’être rincée pendant la capture cellulaire, mais aussi fournir suffisamment d’espace pour les cellules de se propager, proliférer et migrer, permettant d’observer les interactions vivantes unicellulaire. Dans cet article, nous nous concentrons sur la production de cet appareil et les étapes détaillées du protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les interactions intercellulaires de diverses cellules dans le microenvironnement de tumeur jouent un rôle important dans la progression de la tumeur17. Afin de comprendre le mécanisme des interactions cellules-cellules, les systèmes de co-culture sont utilisés comme méthode d’analyse commune. Cependant, plusieurs types de cellules et l’hétérogénéité des cellules elles-mêmes ont conduit à la complexité expérimentale et des difficultés analytiques.
La puce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par une subvention du ministère des Sciences et de la Technologie (105-2628-E-400-001-MY2), et du Programme de doctorat en génie tissulaire et en médecine régénérative, de l’Université nationale Chung Hsing et des Instituts nationaux de recherche en santé.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O’hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
