פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתק ולמיין אוכלוסיית תאים מסוימת של בלוטות אביזר זכר Drosophila ילה (תאים משניים) עבור רצפי RNA ו-RT-qpcr. בידוד התא מושגת באמצעות הטיהור של FACS של התאים המשניים של GFP-ביטוי לאחר תהליך מרובה שלב-דיסוציאציה המחייב ניתוח, העיכול הפרוטסיס ופיזור מכני.
Abstract
כדי להבין את הפונקציה של איבר, לעתים קרובות שימושי להבין את התפקיד של אוכלוסיית התאים המכוננת שלה. למרבה הצער, הנדירות של אוכלוסיות תאים בודדות מקשה בדרך כלל להשיג מספיק חומר למחקרים מולקולריים. לדוגמה, בלוטת האביזרים של מערכת הרבייה הגברית של דרוזוהילה מכילה שני סוגי תאי הפרשה נפרדים. התאים העיקריים לפצות 96% של התאים הפרשה של בלוטת, בעוד התאים המשניים (SC) לפצות את הנותרים 4% של תאים (כ 80 תאים לזכר). למרות ששני סוגי התא לייצר רכיבים חשובים של נוזל הזרע, רק כמה גנים ידועים להיות ספציפיים ה scs. הנדירות של ה scs יש, עד כה, מפריע ניתוח הטרנססקריפט המחקר של סוג תא חשוב זה. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת טיהור של ה scs עבור החילוץ RNA ורצפי. הפרוטוקול מורכב בלוטות הניתוח הראשון מפני זבובים המבטא כתבת GFP ספציפיים SC ולאחר מכן לאשר את הבלוטות הללו לעיכול פרוטאז ודיסוציאציה מכנית כדי להשיג תאים בודדים. בעקבות שלבים אלה, בודדים, חיים, מסומנים GFP תאים ממוינים באמצעות מסדר פלורסנט המופעל התא (FACS) לטיהור RNA. הליך זה התשואות RNAs ספציפי SC מ ~ 40 גברים לכל תנאי עבור במורד RT-qPCR ו/או רצפי RNA במהלך יום אחד. המהירות והפשטות של ההליך מאפשר הטרנססקריפט של זבובים שונים רבים, מתוך גנוטיפים שונים או תנאים סביבתיים, להיקבע בפרק זמן קצר.
Introduction
איברים מורכב מסוגי תאים מרובים, כל אחד עם פונקציות דיסקרטית ולפעמים לבטא קבוצות שונות בהרבה של גנים. כדי לקבל הבנה מדויקת של אופן הפעולה של איבר, זה לעתים קרובות קריטי ללמוד כל סוג תא שונה שיוצר את האיבר הזה. אחת השיטות הראשיות המשמשות לחקר הפונקציה האפשרית היא ניתוח להמרה. שיטה רבת עוצמה זו מספקת תמונה של הביטוי הגנטי בתא, כדי לחשוף תהליכים ומסלולים פעילים. עם זאת, סוג זה של ניתוח קשה לעתים קרובות עבור אוכלוסיות תאים נדירים שיש לטהר מתאים השכנה הרבה יותר שופע. לדוגמה, בלוטת העזר הגברית דרוזוהילה היא איבר שנוצר בעיקר משני סוגי תאי הפרשה. ככל שהנדירים יותר מבין שני סוגי התא מורכב רק 4% מהתאים של בלוטה זו, השימוש בניתוח מסוג תא מסוים לא היה בשימוש כדי לעזור לקבוע את הפונקציה של תאים אלה.
בלוטות האביזרים (AGs) הם איברים של מערכת הרבייה הגברית בחרקים. הם אחראים לייצור של רוב החלבונים של נוזל הזרע (חלבונים נוזלי הזרע (SFPs) ו בלוטת אביזר חלבונים (ACPs)). חלק אלה SFPs ידועים כדי לזרז את התגובות הפיסיולוגיים והתנהגותיים בנשים מזדווג, שנקרא בדרך כלל תגובה לאחר ההזדווגות (PMR). חלק מה ‘ כוללים: ביוץ מוגבר וקצב הנחת ביצים, אחסון ושחרור של זרע, שינוי בתזונה נשית וירידה בקבלה נשית לגברים מחזרים משניים1,2. כמו חרקים המשפיעים על סוגיות חברתיות גדולות רבות מבריאות האדם (כמו וקטורים עבור מחלות קטלניות) לחקלאות (חרקים יכולים להיות מזיקים, אך הם קריטיים להאבקה ולאיכות הקרקע), הבנת שעתוק חרקים הוא תחום חשוב של מחקר. המחקר של AGs ו-ACPs כבר מתקדמים באופן משמעותי עם האורגניזם מודל Drosophila ילה מלאנוגסטר. מחקרים אלה הדגישו את התפקיד של AGs וחלק מהחלבונים הבודדים שהם מייצרים ביצירת pmr, להשפיע על העבודה במינים אחרים כמו aedes המחלה וקטור aמצרים3,4, וחרקים אחרים1 ,5. יתר על כן, כמו AGs להפריש את המרכיבים של נוזל הזרע1,6 הם נחשבים לעתים קרובות כאנלוגי פונקציונלי של בלוטת הערמונית היונקים הזרע. פונקציה זו דומה בשילוב עם דמיון מולקולרי בין שני סוגי הרקמה, עשו את AGs מודל עבור בלוטת הערמונית זבובים7.
בתוך מעשה זכר, יש שתי אונות של בלוטות אביזר. כל אונה ניתן לראות כמו מבנה סאק כמו שק העשוי מונאולייר של תאים הפרשה סביב לומן מרכזי, עטוף על ידי שרירים חלקים. כפי שהוזכר לעיל, יש שני מורפולוגית, פיתוח מבחינה מנטלית ופונקציונלית הסוד סוגי תאים ממציא בלוטה זו: התאים העיקריים בצורת מצולע (לפצות ~ 96% של התאים), והגדול, תאים משניים עגולים (SC) (ממציא את ה הנותרים 4% של תאים, או כ 40 תאים לכל אונה). זה הוכח כי שני סוגי התא לייצר סטים שונים של ACPs כדי לגרום ולתחזק את PMR. רוב הנתונים שהושגו עד היום להדגיש את התפקיד של חלבון יחיד מפעילה את רוב ההתנהגויות האופייניות של PMR. חלבון זה, פפטיד המין, הוא קטן, 36 הפפטיד חומצות אמינו המופרש על ידי התאים העיקריים8,9,10. למרות פפטיד מין נראה לשחק תפקיד מרכזי pmr, acps אחרים, המיוצר על ידי שני התאים העיקריים והמשני, הוכחו גם להשפיע על היבטים שונים של pmr11,12,13,14 ,15,16,17. לדוגמה, בהתבסס על הידע הנוכחי שלנו, ה scs, דרך החלבונים שהם מייצרים, נראה צורך לנצח של איתות SP לאחר היום הראשון18.
לאור הנדירות של ה scs (רק 80 תאים לזכר), כל הידע שלנו על התאים האלה ואת החלבונים שהם מייצרים מגיע גנטיקה וגישות המועמדים. עד כה, רק רשימה קטנה יחסית של גנים הוכח להיות מוגדר SC. רשימה זו כוללת את החלבון הביאואואמין הפגום הבלוטות (dve)19, האינקרונה מס ‘ 20, Rab6, 7, 11 ו 1921, CG1656 ו CG1757511, 15,21 והומבוקס מקדם התמלול הבטן-b (עבד-ב)18. בעבר, הצגנו כי מוטציה לקויה הן הביטוי של עבד-B ו- lncRNA מס בתאים משניים (מעבדה-6cocuD1 מוטציה) מקצר את אורך pmr מ ~ 10 ימים רק יום אחד12 , מיכל בן 18 , 20. הפנוטיפ הזה נראה כתוצאה מאחסון לא תקין של SP במערכת הרבייה הנשית12,18,20. במישור הסלולר, התאים המשניים של המוטציות האלה מראים מורפולוגיה לא נורמלית, ומאבדים את המבנה האופייני שלהם במבנים שלהם18,20,21. באמצעות קו זה מוטציה, בעבר ניסינו לזהות גנים המעורבים בפונקציה SC על ידי השוואת הפרופילים הטרנססקריפט של AGs שלמים מסוג פראי או בלוטות אביזר מוטציה12. כמו כן, מעבדות אחרות הראו כי מספר SC, מורפולוגיה ומין תוכן וולאואר תלוי בתזונה גברית, סטטוס ההזדווגות וגיל21,25,26.
למרות התקדמות חיובית נעשתה באמצעות גישות אלה, מלאה SC ההמרה היה רחוק מושגת. האטימות של תאים אלה באיבר זה הפכה את זה קשה להתקדם עוד יותר בתאי סוג פראי. לבדיקת ביטוי גנים, שינויים בתאים אלה לאחר גירויים סביבתיים מסוימים יהיה אפילו קשה יותר. כך, שיטה לבידוד וטיהור SC RNA כי היה מהיר ופשוט מספיק כדי לבצע תחת רקעים גנטיים שונים ותנאים סביבתיים היה צורך.
הגנים של עבד-B ו- מס ‘ מס ‘ דורשים משפר ספציפי של 1.1 kb ממתחם דרוזוהילה בבית החזה (המכונה D1 משפר) על ביטויו בה scs18,20. משפר זה בעבר נעשה שימוש כדי ליצור מנהל התקן GAL4 , כאשר משויך UAS-gfp, הוא מסוגל לנהוג ביטוי gfp חזק במיוחד ב ה scs. לפיכך, השתמשנו בשורה זו כבסיס לפרוטוקול FACS לבידוד תאים אלה מסוג פראי וממעבדה-6cocuD1 AGs). כמו המעבדה -6cocuD1 מוטציה ה scs להציג מורפולוגיה סלולרית שונים, אנו מראים כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לבודד תאים לקביעת ההמרה שלהם מסוג זה תא נדיר תחת תנאים שונים בהרבה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות לדיסוציאציה של תא מרקמת דרוזוהילה כמו דיסקים מתוארים כמתואר כבר23. הניסיונות שלנו פשוט להשתמש בהליכים אלה על בלוטות האביזר נכשלו, מעודדים אותנו לפתח את הפרוטוקול החדש. העיכול הפרוטאז והטריטורציה המכנית היו צעדים קריטיים שאנחנו בצרות ירו להצלחת ההליך, ואנו מניחים ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לחברי מעבדת Karch, לplateform הגנומיקה הiGE3, למתקן הליבה של המרכז האוניברסיטאי של ז’נבה, ולדר ‘ ז’אן-פייר אוברי-לבאיי שקבע את הפרוטוקול ל-FACS. אנו מודים ללוקה Stickley על עזרתו באמצעות להמחיש את הקריאות ב IGV. אנו מודים לעצמנו על הרשאה עדינה לשימוש חוזר בדמויות, והעורכים המבקשת מאיתנו להיות יצירתיים בכתיבה.
מחקר זה מומן על ידי מדינת ז’נבה (CI, RKM, FK), הקרן הלאומית השוויצרית למחקר (www.snf.ch) (FK ו RKM) ותרומות של קרן Claraz (FK).
Materials
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. 유전학. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
