콜라겐 유도 관절염 모델에서 조직 염증의 분자 경로를 평가하기 위한 마우스 발 처리를 위한 저온 분쇄 프로토콜
Summary
액체 질소 냉동고 밀을 사용하여 뮤린 발을 처리하는 극저온 분쇄 방법은 조직에서 추출 된 RNA 또는 단백질의 수율과 품질을 개선하고 염증과 관련된 분자 프로파일의 분석을 가능하게하기 위해 개발되었습니다. 응답.
Abstract
국소 조직에서 의 분자 변화를 프로파일링은 생체 내에서 치료 후보의 작용의 메커니즘(들)을 이해하는 데 매우 중요하다. 관절염 연구 분야에서, 많은 연구는 뼈의 복잡한 혼합물로 구성된 염증 관절에 초점을 맞추고, 연골, 근육, 기질 세포와 면역 세포. 여기에서, 우리는 극저온 통제된 환경에서 균일한 분쇄된 견본으로 불을 붙인 마우스 발을 중단하는 믿을 수 있고 강력한 기계적인 방법을 설치했습니다. 단백질 및 RNA 분해제는 국소 조직에서 관련 질병 경로의 단백질 및 전사 종점 및 분자 특성을 가능하게 하기 위해 처리되었습니다.
Introduction
류마치스성 관절염 (RA)는 피부, 심혼, 폐 및 눈과 같은 기관의 합동 그리고 추가 관절 에 있는 지속적인 대칭 활막염을 가진 만성 조직 선동적인 질병1. 면역 반응의 전신 발현은 인간 환자에서 분명하지만, RA 병리학의 특징 중 하나는 활액 상 조직내 면역 세포의 침투및 활액 섬유 아세포의증식2.
인간 RA와 유사하게, 마우스 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 모델은 활액 조직 및 전신 구획에 있는 활성 면역 반응으로 강한 조직 염증을 이끌어 냅니다. CIA 모델에 대한 상이한 마우스 균주의 감수성은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) haplotype 및 항원 특이적 T 세포 및 B 세포 상호작용3,4로연결된다. 또한, 자가 항체 생산, 면역 복합체 침착, 골수성 세포 활성화, 활액 면역 침윤을 통한 다관절 증상 및 판누스 형성을 포함한 인간 RA의 많은 병원성 경로도 이 모델에서 분명하게 드러납니다. 5,6. 수사관은 항 염증 성 사이토 카인 치료의 효과를 조사하기 위해이 잘 설립 된 CIA 모델을채택7. 항-TNFα 및 항-IL-6과 같은 자가면역 또는 염증성 질환에 대해 승인된 많은 생물학적 제제는 CIA 모델8,9에서효과적인 것으로 밝혀졌다.
활액 조직에서 면역 계통의 상호 작용을 프로파일링은 RA의 병인과 관련되었던 분자 기계장치를 해명하기 위하여 결정적이다. 인간 임상 환경에서, 일반적인 관행은 초음파 화상 진찰의 지도의 밑에 바늘 활액 생검을 능력을 발휘하는 것입니다. 전임상 환경에서, 뮤린 관절의 작은 구조는 불가능하지 않을 경우 생검 절차를 훨씬 더 어렵게 만듭니다. 최근에는 이질적인 종점에 영향을 미치고 질병을 해결하는 약물의 조합을 평가하기 위해 뮤린 CIA 모델의 활용도를10으로입증했다. 극저온 냉동고 밀 기반 분쇄 방법은 염증이 있는 뮤린 발을 균일한 미세 분말로 처리하고 RNA와 단백질을 추출하기 위해 하류 공정을 확립하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 효소 및 화학 적 탈지 공정으로부터 RNA 및 단백질을 보호하고 단일 균질화 된 샘플 소스에 여러 분석 방법을 적용 할 수 있게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
활액 조직에서 분자 경로를 평가하는 강력한 과학적 근거가 있지만, 뮤린 CIA 모델의 면역 프로파일링에 대한 많은 보고서는 말초 혈액에 초점을 맞춘 반면 염증이있는 발의 단백질 및 RNA 분석 데이터는 다소 제한적입니다. 이 편견에 대한 몇 가지 가능한 이유가 있습니다 : 뮤린 발목 관절은 ~ 2cm보다 크지 않습니다. 영향 받은 지역은 조직 분쇄기, 유봉 및 박격포, 실리카 비드 중단, trituration 또는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 원고의 출판을 지지해 준 에디스 얀센과 나빈 라오와 제니퍼 타운에 대한 비판적 검토에 감사를 표하고자 한다.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
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