פרוטוקול הקפאה-מתישה לעיבוד כפות העכבר כדי להעריך מסלולים מולקולריים של דלקת רקמות במודל דלקת מפרקים קולגן המושרה
Summary
שיטה מתישה קריוגניים כדי לעבד כפות מורתיות באמצעות טחנת חנקן נוזלי המקפיא פותחה כדי לשפר את התשואה והאיכות של RNA או חלבון שחולצו מן הרקמות ולאפשר ניתוח של פרופילים מולקולריים הקשורים דלקתיות תגובות.
Abstract
יצירת פרופילים של שינויים מולקולריים ברקמות המקומיות חיונית להבנת המנגנון (ים) של פעולה של מועמדים טיפוליים בvivo. בתחום של מחקר דלקת פרקים, מחקרים רבים מתמקדים המפרקים דלקתית המורכבת תערובת מורכבת של עצם, סחוס, שריר, סטרומה תאים ותאים חיסוניים. כאן, הקמנו שיטה מכנית אמינה ואיתנה כדי לשבש כפות העכבר מודלק לתוך דגימות הומוגנית מרוסק בסביבה מבוקרת קריובית. חלבון ו-RNA lysates היו מעובדים כדי לאפשר את נקודות הקצה של פרוטאומית וטרנססקריפט ואפיון מולקולרי של מסלולים רלוונטיים למחלות ברקמה המקומית.
Introduction
דלקת מפרקים שיגרונית (RA) היא מחלה דלקתית כרונית מערכתית עם דלקת סימטרי מתמשך במפרקים ומעורבות נוספת של איברים כגון העור, הלב, הריאות, ועיניים1. למרות הביטויים מערכתית של התגובה החיסונית ניכרת בחולים אנושיים, אחד הסימנים ההיכר של הפתולוגיה RA הוא הסתננות של תאים חיסוניים ברקמת אמתחת והתפשטות של תאים מערכת פיברונובקבוקון2.
בדומה RA אנושי, העכבר קולגן המושרה דלקת מפרקים (CIA) מודל מעורר דלקת רקמה חזקה עם תגובות החיסון פעיל ברקמות אמתחת ו מערכתית תאים. הרגישות של זנים שונים של העכבר כדי CIA מודל קישורים לקומפלקס היסטליקציות העיקריים (mhc) haplotype ו אנטיגן מסוים תא T אינטראקציה עם תא2,4. בנוסף, מסלולים פתוגניים רבים ב-RA האנושי, כולל הפקת נוגדן אוטומטי, מורכבות החיסון המערכת, הפעלת תא מיאלואידית, ביטויים פוליפרגניים והיווצרות pannoבקבוקון עם חדירה חיסונית מערכת, הם גם ברור במודל זה 5,6. החוקרים המועסקים במודל זה מבוסס היטב CIA כדי לחקור את ההשפעות של טיפולי ציטוקין אנטי דלקתיות7. ביולוגי רבים מאושרים עבור מחלות אוטואימוניות או דלקתיות, כגון אנטי-tnfα ו anti-IL-6, נמצאים יעיל במודל ה-CIA8,9.
יצירת פרופיל האינטראקציות של המערכת החיסונית ברקמת אמתחת היא חיונית כדי להבהיר מנגנונים מולקולריים הקשורים בפתוגנזה של RA. בסביבה הקלינית האנושית, מנהג נפוץ הוא לבצע ביופסיות מערכת המחט תחת הדרכתו של הדמיה אולטרסאונד. בהגדרות טרום קלינית, הארכיטקטורה הקטנה של המפרקים murine עושה הליכים ביופסיה הרבה יותר קשה אם לא בלתי אפשרי. לאחרונה, הדגמנו את הניצול של הדגם murine CIA כדי להעריך שילובים של תרופות כדי להשפיע על נקודות קצה שונים ולפתור את המחלה בגישה קומבינטורית10. מקפיא ההקפאה טחנת המכונה שיטת הטחינה היה מועסק כדי לעבד כפות מורתיות מודלק לתוך אבקות בסדר הומוגנית והקימו תהליכי הזרם כדי לחלץ RNA וחלבונים. שיטה זו מגינה על RNA וחלבונים מתהליכים degrative מגמטיים וכימיים ומאפשרת לנו להחיל שיטות אנליטיות מרובות על מקור יחיד הומוגניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שיש הרציונל המדעי חזק להעריך מסלולים מולקולריים ברקמות אמתחת, דיווחים רבים על פרופיל החיסון של מודל ה-CIA murine התמקדו דם היקפי, בעוד חלבונים ו-RNA ניתוח נתונים של כפות מודלק הם מוגבלים למדי. ישנן מספר סיבות אפשריות להטיה זו: מפרקי הקרסול של מוריין אינם גדולים מ-~ 2 ס מ; האזורים המושפעים מור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לאדית ג’סן על הסקירה הקריטית של כתב היד וNavin ראו וג טאון על תמיכתם בפרסום כתב היד הזה.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
