En pulverisering protokoll for behandling mus paws å evaluere molekylær trasé av vev betennelse i en kollagen indusert artritt modell

Summary

En kryogene pulverisering metode for å behandle murine poter ved hjelp av en flytende nitrogen fryser Mill ble utviklet for å forbedre utbyttet og kvaliteten på RNA eller protein utvunnet fra vev og muliggjøre analyse av molekylære profiler forbundet med inflammatoriske Svar.

Abstract

Profilering av molekylære endringer i lokalt vev er avgjørende for å forstå mekanismen (e) av terapeutiske kandidater i vivo. Innen leddgikt forskning, er mange studier fokusert på betente ledd som består av en kompleks blanding av bein, brusk, muskel, stromal celler og immunceller. Her etablerte vi en pålitelig og robust mekanisk metode for å forstyrre betent mus poter i homogene pulverisert prøver i et cryogenically kontrollert miljø. Protein og RNA lysater ble behandlet for å muliggjøre Proteomikk og transcriptional endepunkter og molekylær karakterisering av relevante sykdoms baner i lokalt vev.

Introduction

Revmatoid artritt (RA) er en kronisk systemisk inflammatorisk sykdom med vedvarende symmetrisk synovitt i ledd og ekstra ledd involvering av organer som hud, hjerte, lunger og øyne¹. Selv om de systemiske manifestasjoner av immunresponsen er tydelig i menneskelige pasienter, en av kjennetegnene til RA patologi er infiltrasjon av immunceller i synovial vev og spredning av synovial Fibroblast celler².

I likhet med menneskelig RA, mus kollagen indusert artritt (CIA) modell utløser sterk vev betennelse med aktive immunresponser i synovial vev og systemiske avdelinger. Mottakelighet av ulike mus stammer til CIA-modellen lenker til store histocompatibility kompleks (MHC) haplotype og antigen spesifikke T celle og B celle interaksjoner^3,4. I tillegg er mange patogene veier i menneskets RA, inkludert autoantistoff produksjon, immun komplekse deponering, myelogen celle aktivering, polyartikulær manifestasjoner og pannus dannelse med synovial immun infiltrasjon, også tydelig i denne modellen ^5,6. Etterforskerne har brukt denne veletablerte CIA-modellen for å undersøke virkningene av anti-inflammatorisk cytokin behandlinger⁷. Mange biologiske medisiner godkjent for autoimmune eller inflammatoriske sykdommer, slik som anti-TNFα og anti-Il-6, er funnet å være effektiv i CIA modell^8,9.

Profilering av interaksjoner i immunsystemet i synovial vev er avgjørende for å belyse molekylære mekanismer knyttet til patogenesen av RA. I den menneskelige kliniske innstillingen, er en vanlig praksis å utføre nål synovial biopsier under veiledning av Ultralyd Imaging. I prekliniske innstillingene, gjør den mindre arkitekturen i murine leddene biopsi prosedyrer mye vanskeligere om ikke umulig. Nylig demonstrerte vi utnyttelsen av murine CIA-modell for å evaluere kombinasjoner av medikamenter for å påvirke ulike sluttpunkter og løse sykdom i en Kombinatorisk tilnærming¹⁰. En kryogene fryseboks Mill-basert pulverisering metode ble brukt til å behandle betent murine poter i homogen fint pulver og etablerte nedstrøms prosesser for å trekke ut RNA og proteiner. Denne metoden beskytter RNA og protein fra enzymatisk og kjemiske degrative prosesser og gjør det mulig for oss å anvende flere analytiske metoder til en enkelt homogenisert prøvekilde.

Protocol

Alle dyre eksperimenter ble utført i henhold til retningslinjene for den institusjonelle dyre omsorgen og bruks komitéen (IACUC) til Janssen R & D. 1. kryogene fryser Mill-basert pulverisering metode Ved opphør av CIA-studien, offer mus med 1,5% isoflurane etterfulgt av cervical forvridning. På dagen for vev behandling, pre-chill alle instrumenter (spatler, sliping hetteglass, etc.) på tørr is i minst 10 min. Bruk termiske hansker for å unngå Frostskade. S…

Representative Results

Her viser vi en representativ gel bilde visualisering av RNA utvunnet fra fronten poter av CIA-mus i figur 2a. 28S rRNA og 18S rRNA-båndet viser at alle prøvene har tilstrekkelig mengde intakt RNA. Deretter viser vi en representativ scatter plott av totale protein konsentrasjoner basert på protein BCA analyse i figur 2B. Totale protein konsentrasjoner fra naive mus, CIA-mus eller CIA-mus under…

Discussion

Selv om det er sterk vitenskapelig begrunnelse for å evaluere molekylære trasé i synovial vev, mange rapporter om immun profilering av murine CIA-modellen var fokusert på perifert blod, mens protein og RNA analysedata av betente poter er ganske begrenset. Det er flere mulige årsaker til denne bias: murine ankel leddene er ikke større enn ~ 2 cm; de berørte områdene består av hud, bein og bindevev som ofte er vanskelig å homogenisere ved hjelp av tradisjonelle metoder som vev kverner, morter og mørtel, silica p…

Materials

5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing