Крио-распыления Протокол для обработки мышь лапы для оценки молекулярных путей воспаления тканей в коллагениндовой модели артрита
Summary
Криогенный метод распыления для обработки мурин лап с помощью жидкого азота морозильной мельницы был разработан для улучшения урожайности и качества РНК или белка, извлеченного из тканей и позволяют анализ молекулярных профилей, связанных с воспалительными Ответы.
Abstract
Профилирование молекулярных изменений в местных тканях имеет решающее значение для понимания механизма (ы) действия терапевтических кандидатов in vivo. В области исследований артрита, многие исследования сосредоточены на воспаление суставов, которые состоят из сложной смеси костей, хряща, мышц, стромальных клеток и иммунных клеток. Здесь мы создали надежный и надежный механический метод для разрушения воспаленных мышей лап в однородные распыленные образцы в криогенно контролируемой среде. Белки и РНК-лизаты были обработаны для обеспечения протеомных и транскрипционных конечных точек и молекулярной характеристики соответствующих путей заболевания в местной ткани.
Introduction
Ревматоидный артрит (РА) является хроническим системным воспалительным заболеванием с стойким симметричным синовитом в суставах и дополнительным суставным участием органов, таких как кожа, сердце, легкие и глаза1. Хотя системные проявления иммунного ответа очевидны у пациентов, одной из отличительных черт патологии РА является проникновение иммунных клеток в синовиальную ткань и пролиферация синовиальных фибробластных клеток2.
Как и в человеческой РА, мышь коллагена индуцированных артрита (ЦРУ) модель вызывает сильное воспаление тканей с активными иммунными реакциями в синовиальных тканей и системных отсеков. Восприимчивость различных штаммов мыши к модели ЦРУ ссылки на основные гистосовместимости комплекса (MHC) гаплотип и антиген конкретных Т-клеток и B-клеточных взаимодействий3,4. Кроме того, многие патогенные пути в организме человека, в том числе производство аутоантител, иммунный комплекс осаждения, активация миелоидных клеток, полиартикулярные проявления и формирование паннуса с синовиальной иммунной инфильтрацией, также проявляются в этой модели 5,6. Следователи использовали эту устоявшуюся модель ЦРУ для расследования последствий противовоспалительных цитокинов лечения7. Многие биопрепараты, одобренные для аутоиммунных или воспалительных заболеваний, таких как анти-ТНФЗ и анти-IL-6, оказались эффективными в модели ЦРУ8,9.
Профилирование взаимодействий иммунной системы в синовиальной ткани имеет решающее значение для выяснения молекулярных механизмов, связанных с патогенезом РА. В клинических условиях человека, распространенная практика заключается в выполнении иглы синовиальной биопсии под руководством ультразвуковой визуализации. В доклинических условиях меньшая архитектура муринских суставов делает процедуры биопсии гораздо более сложными, если не невозможными. Недавно мы продемонстрировали использование модели murine ЦРУ для оценки комбинаций препаратов для воздействия разрозненных конечных точек и разрешения болезни в комбинаторном подходе10. Для обработки воспаленные муринные лапы в однородные мелкие порошки был использован криогенный морозильный метод мельницы на основе мельницы. Этот метод защищает РНК и белок от ферментативных и химических дегративных процессов и позволяет нам применять несколько аналитических методов к одному гомогенизированному источнику образца.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя есть сильное научное обоснование для оценки молекулярных путей в синовиальных тканях, многие доклады об иммунном профилировании модели ЦРУ были сосредоточены на периферической крови, в то время как данные анализа белка и РНК воспаленных лап довольно ограничены. Есть несколько во…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Эдит Янссен за критический обзор рукописи и Навин Рао и Дженнифер Таун за поддержку публикации этой рукописи.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
