Essai sur place légère pour l'analyse de Drosophila Larval Phototaxis

Summary

Ce protocole introduit un essai de tache de lumière pour étudier le comportement phototactic larvaire de Drosophila. Dans cet analyse, un point lumineux est généré sous forme de stimulation lumineuse, et le processus d’évitement de la lumière larvaire est enregistré par un système d’imagerie infrarouge à base de lumière.

Abstract

Les larves de Drosophila melanogaster montrent un comportement évident d’évitement de la lumière pendant le stade de la recherche de nourriture. Drosophila larval phototaxis peut être utilisé comme un modèle pour étudier le comportement d’évitement des animaux. Ce protocole introduit un essai de tache de lumière pour étudier le comportement phototactic larvaire. La configuration expérimentale comprend deux parties principales : un système de stimulation visuelle qui génère la tache lumineuse, et un système d’imagerie infrarouge basé sur la lumière qui enregistre le processus d’évitement de la lumière larvaire. Cet analyse permet de suivre le comportement de la larve avant d’entrer, lors de la rencontre, et après avoir quitté la tache lumineuse. Les détails du mouvement larvaire, y compris la décélération, la pause, le moulage de la tête et le virage, peuvent être capturés et analysés à l’aide de cette méthode.

Introduction

Les larves de Drosophila melanogaster montrent un comportement évident d’évitement de la lumière pendant le stade de la recherche de nourriture. Drosophila larval phototaxis a fait l’objet d’une enquête, en particulier dans les 50 dernières années^1,2,3,4,5,6^{,7 ,8}. Ces dernières années, malgré le fait que 1) de nombreux neurones médiateurs de l’évitement de la lumière larvaire ont été identifiés^{4,5,9,10,11,12} et 2) le connectome complet du système visuel larvaire à la résolution des synapses a été établi^13,les mécanismes neuronaux sous-jacents phototaxis larvaires restent en grande partie peu clairs.

Un certain nombre d’essais comportementaux ont été utilisés dans l’étude de la phototaxie larvaire. Ils peuvent être en grande partie divisés en deux classes : l’une impliquant des gradients de lumière spatiale et l’autre impliquant des gradients de lumière temporelle. Pour les essais de gradient de lumière spatiale, l’arène est divisée en nombre égal de sections dans la lumière et l’obscurité. L’arène peut être divisée en moitiés de lumière et sombres^2,4 ou quadrants de lumière et sombre^{s’il y}a 14^,15, ou peut même être séparée en carrés alternatifs de lumière et sombres comme sur un damier⁷. Habituellement, les plaques d’agar sont utilisées pour l’analyse de gradient de lumière spatiale, mais les tubes qui sont divisés en sections de lumière et d’obscurité alternatives peuvent également être utilisés^10,14.

Dans l’ancienne version des essais, l’éclairage lumineux provient généralement de dessous les larves. Cependant, l’illumination dans les versions plus récentes provient en grande partie d’en haut, puisque les yeux larvaires (par exemple, les organes du Bolwig qui sont sensibles aux intensités de lumière faible ou moyenne¹⁶) sont contenus dans le squelette céphalopharyngé opaque avec des ouvertures vers l’avant supérieur. Cela rend les larves plus sensibles à la lumière par les directions avant supérieures que par le bas derrière les directions⁷. Pour les essais de gradient de lumière temporelle, l’intensité lumineuse est spatialement uniforme dans l’arène, mais l’intensité change avec le temps. En plus de la lumière temporelle des ondes carrées (c.-à-d. clignotant/off ou lumière forte/faible^3,7), la lumière temporellement variable qui se conforme à une rampe linéaire d’intensité est également utilisée⁸ pour mesurer la sensibilité des larves à un changement temporel de stimulus de la lumière.

Un troisième type d’essai de phototaxis est la navigation directionnelle de paysage de lumière, qui implique l’illumination d’en haut à un angle de 45^‘7. Avant les travaux de Kane et coll.⁷, seuls des paramètres grossiers tels que le nombre de larves dans les régions sombres et légères, la fréquence des virages et la longueur des sentiers ont été calculés dans les essais de phototaxis larvaires. Depuis le travail de ce même groupe, avec l’analyse de l’enregistrement vidéo à haute résolution temporelle pour la phototaxie larvaire, dynamique détaillée du mouvement larvaire pendant la phototaxie (c.-à-d., vitesses instantanées de différentes parties du corps larvaire, direction de cap, angle de rotation et la vitesse angulaire correspondante) ont été analysés⁷. Ainsi, plus de détails sur le comportement de la phototaxis larvaire ont pu être découverts. Dans ces essais, les larves sont testées en groupes afin que les effets de groupe ne soient pas exclus.

Ce protocole introduit un analyse de tache légère pour l’étude des réponses comportementales larvaires à la stimulation lumineuse individuelle. La principale installation expérimentale consiste en un système de stimulation visuelle et un système d’imagerie infrarouge à base de lumière. Dans le système de stimulation visuelle, une source lumineuse LED génère une tache lumineuse ronde de 2 cm de diamètre sur une plaque d’agar, où la larve est testée. L’intensité lumineuse peut être ajustée à l’aide d’un pilote LED. Le système d’imagerie comprend une caméra infrarouge qui capture le comportement de la larve en plus de trois LED infrarouges de 850 nm qui fournissent l’éclairage pour la caméra. L’objectif de la caméra est recouvert d’un filtre de 850 nm pour empêcher la lumière du système de stimulation visuelle d’entrer dans la caméra, tandis que la lumière infrarouge est autorisée à entrer dans la caméra. Ainsi, l’interférence de la stimulation visuelle sur l’imagerie est évitée. Dans cet analyse, les détails comportementaux des réponses rapides des larves individuelles au cours d’une période, y compris avant, pendant et après l’entrée de la lumière sont enregistrés et analysés.

Protocol

1. Préparation des larves de Drosophila Préparer le milieu standard composé de farine de maïs bouillie (73 g), d’agar (5,6 g), de farine de soja (10 g), de levure (17,3 g), de sirop (76 ml) et d’eau (1000 ml). Soulevez toutes les mouches à 25 oC sur le milieu standard dans une pièce avec un cycle clair/foncé de 12 h/12 h. 2. Préparation des plaques d’agar Préparer une solution d’agar de 1,0 %. Peser 3 g d’agar dans un bécher de 500 ml avec…

Representative Results

Selon le protocole, l’analyse de tache lumineuse a été employée pour étudier le comportement d’évitement de lumière de la troisième larve d’étoile qui ont été soulevées à 25 oC sur le milieu standard dans une pièce avec un cycle de lumière/obscurité de 12 h/12 h. Une seule larve w1118 a été testée à l’aide de l’analyse de la tache lumineuse à 25,5 oC. L’intensité lumineuse moyenne de la tache lumineuse générée par une LED de 460 nm était de 0,59 W/cm2. L’ensemble d…

Discussion

Ce protocole présente l’analyse des points lumineux pour tester la capacité des larves de Drosophila à s’échapper de la lumière. Cet analyse permet de suivre le comportement des larves avant d’entrer, lors de la rencontre et après avoir quitté un point lumineux. Les détails du mouvement larvaire peuvent être capturés et analysés. L’argument de la tache lumineuse est très simple et possède une forte praticabilité. Le coût de l’ensemble de l’appareil n’est pas élevé. Dans l’expérience, la lumièr…

Materials

850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120˚ Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%