الفحص الضوئي القائم علي الضوء لتحليل دروتواكسيس
Summary
يقدم هذا البروتوكول فحصا للضوء للتحقيق في سلوك التصوير الضوئي ليرقات دروفيا لارفال. في هذا الفحص ، يتم إنشاء بقعه ضوئيه كمحفز للضوء ، ويتم تسجيل عمليه تجنب ضوء اليرقات بواسطة نظام تصوير قائم علي ضوء الاشعه تحت الحمراء.
Abstract
تظهر يرقات دروفوسيلا الصباغية الضوء الواضح-تجنب السلوك اثناء مرحله الشيخوخة. يمكن استخدام الصور الضوئية كنموذج لدراسة سلوك تجنب الحيوانية. هذا البروتوكول يقدم فحص بقعه ضوء للتحقيق في السلوك الضوئي اليرقة. وتشمل المجموعة التجريبية جزاين رئيسيين: نظام التحفيز البصري الذي يولد البقعة الضوئية ، ونظام التصوير الضوئي القائم علي ضوء الاشعه تحت الحمراء الذي يسجل عمليه تجنب الضوء اليرقة. يسمح هذا الفحص بتتبع سلوك اليرقة قبل الدخول ، واثناء المواجهة ، وبعد ترك البقعة المضيءه. تفاصيل حركه يرقات بما في ذلك التباطؤ ، وقفه ، صب الراس ، وتحول يمكن التقاطها وتحليلها باستخدام هذا الأسلوب.
Introduction
تظهر يرقات دروفوسيلا الصباغية الضوء الواضح-تجنب السلوك اثناء مرحله الشيخوخة. وقد تم التحقيق في دروفيسيلا ليرقات الفوتواكسيس ، وخاصه في السنوات الماضية 501،2،3،4،5،6،7 ،8. في السنوات الاخيره ، علي الرغم من حقيقة ان 1) وقد تم تحديد العديد من الخلايا العصبية التوسط لتجنب ضوء يرقات4،5،9،10،11،12 و 2) وقد أنشئت للاتصال كامله من النظام البصري يرقات في القرار من الاشتباكات العصبية13، واليات العصبية الكامنة وراء phototaxis لا تزال غير واضحة إلى حد كبير.
وقد استخدم عدد من الاختبارات السلوكية في دراسة المحور الضوئي اليرقات. ويمكن تقسيمها إلى حد كبير إلى فئتين: واحده تنطوي علي تدرجات الضوء المكاني والأخرى التي تنطوي علي تدرجات الضوء الصدغي. بالنسبة لاختبارات تدرج الضوء المكاني ، تنقسم الساحة إلى عدد متساو من الأقسام في الضوء والظلام. ويمكن تقسيم الساحة إلى نصفي الضوء والظلام2،4 أو الأرباع الضوء والظلام14،15، أو يمكن حتى ان تكون مفصوله في الضوء البديل والساحات المظلمة مثل علي شطرنج7. عاده ، يتم استخدام لوحات أجار لفحص التدرج الضوء المكاني ، ولكن يمكن أيضا ان تستخدم الأنابيب التي تنقسم إلى الضوء البديل والأقسام المظلمة10،14.
في النسخة القديمة من المقايسات ، تنبع الاضاءه الخفيفة عموما من أسفل اليرقات. ومع ذلك ، الاضاءه في الإصدارات الأحدث تنبع إلى حد كبير من أعلاه ، منذ عيون اليرقات (علي سبيل المثال ، والاجهزه Bolwig التي حساسة لشده الضوء المنخفض أو المتوسط16) وترد في هيكل عظمي البلعوم الأنفي مبهمه مع فتحات نحو الجبهة العليا. وهذا يجعل اليرقات أكثر حساسية للضوء من الاتجاات الاماميه العليا من أدناه وراء الاتجاات7. النسبة لاختبارات تدرج الضوء الصدغي ، فان شده الضوء هي موحده مكانيا في الحلبة ، ولكن الكثافة تتغير مع مرور الوقت. بالاضافه إلى ضوء الموجه الزمنيه المربعة (اي ، وامض علي/قباله أو قويه/ضعيفه الضوء3،7) ، ويستخدم أيضا الضوء الزماني المتغيرة التي تتوافق مع منحدر خطي في كثافة8 لقياس حساسية اليرقات إلى تغيير وقتي التحفيز الخفيفة.
وهناك نوع ثالث من فحص الضوء الضوئي هو الملاحة الخفيفة الاتجاه سكيب ، والتي تنطوي علي الاضاءه من فوق في زاوية من 45 درجه7. قبل عمل كين وآخرون7، تم حساب المعلمات الخشنة فقط مثل عدد من اليرقات في المناطق الخفيفة والداكنة ، وتواتر تحول ، وطول درب في اختبارات فوتوتياكسيس اليرقات. منذ عمل هذه المجموعة نفسها ، مع تحليل عاليه الدقة الزمنيه سجل الفيديو لل phototaxis اليرقات ، والديناميكيات التفصيلية للحركة اليرقات خلال phototaxis (اي ، سرعات فورية من أجزاء مختلفه من الجسم اليرقات ، واتجاه الراس ، وتحول زاوية وقد تم تحليل السرعة الزاوي المقابلة)7. التالي ، تم العثور علي مزيد من التفاصيل من السلوك phototaxis اليرقات. في هذه الاختبارات ، يتم اختبار اليرقات في مجموعات بحيث لا يتم استبعاد تاثيرات المجموعة.
يقدم هذا البروتوكول فحصا موضعيا خفيفا للتحقيق في الاستجابات السلوكية الخاصة باليرقات لتحفيز الضوء الفردي. تتكون المجموعة التجريبية الرئيسية من نظام التحفيز البصري ونظام التصوير الضوئي القائم علي الاشعه تحت الحمراء. في نظام التحفيز البصري ، يقوم مصدر ضوء LED بتوليد بقعه ضوئيه مستديرة قطرها 2 سم علي لوحه أجار ، حيث يتم اختبار اليرقة. يمكن تعديل كثافة الضوء باستخدام برنامج تشغيل LED. ويشمل نظام التصوير كاميرا الاشعه تحت الحمراء التي تلتقط سلوك اليرقة بالاضافه إلى 3 850 nm الاشعه تحت الحمراء المصابيح التي توفر الاضاءه للكاميرا. يتم تغطيه عدسه الكاميرا بواسطة فلتر تمرير الفرقة 850 nm لمنع الضوء من نظام التحفيز البصري من دخول الكاميرا ، بينما يسمح للضوء بالاشعه تحت الحمراء بدخول الكاميرا. التالي ، يتم منع تدخل التحفيز البصري علي التصوير. في هذا الفحص ، يتم تسجيل وتحليل التفاصيل السلوكية للاستجابات السريعة ليرقات الفرد خلال فتره بما في ذلك قبل واثناء وبعد دخول الضوء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعرض هذا البروتوكول فحص البقعة الضوئية لاختبار قدره يرقات دروفيا علي الهروب من الضوء. يسمح هذا الفحص بتتبع سلوك اليرقات قبل الدخول ، واثناء المواجهة ، وبعد ترك بقعه ضوئيه. يمكن التقاط تفاصيل حركه اليرقات وتحليلها. فحص بقعه خفيفه بسيطه جدا وتمتلك المحتملة القوية. تكلفه الجهاز كله ليست…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل مؤسسه العلوم الطبيعية في الصين (31671074) وصناديق البحوث الاساسيه لجامعات مقاطعه تشجيانغ (2019XZZX003-12).
Materials
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120˚ Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
References
- Grossfield, J. Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).
- Godoy-Herrera, R. C. L. D. The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation. Animal Behaviour. 37, (1989).
- Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions. Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends in Neurosciences. 35, (2012).
- Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).
- Humberg, T. H., et al. Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues. Nature Communications. 9. 1260, (2018).
- Gong, Z., et al. Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference. Science. 330, (2010).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341, 1113 (2013).
- Zhao, W., et al. A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference. Nature Communications. 10, (2019).
- Gong, C., et al. A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance. Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).
- Larderet, I., et al. Organization of the Drosophila larval visual circuit. eLife. 6, (2017).
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. Journal of Neurogenetics. 10, (1995).
- Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921 (2010).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, e41642 (2012).
