Dämpning av gnistan: CRISPR/Cas9 genom redigering i svagt elektrisk fisk
Summary
Här presenteras ett protokoll för att producera och bakre CRISPR/Cas9 Genome knockout elektrisk fisk. Beskrivs i detalj är de nödvändiga molekylära biologi, avel och djurhållning krav för både en gymnotiform och en mormyrid, och injektion tekniker för att producera Cas9-inducerad indel F0 larver.
Abstract
Electroreception och electrogenesis har förändrats i den evolutionära historien av ryggradsdjur. Det finns en slående grad av konvergens i dessa oberoende härledda fenotyper, som delar en gemensam genetisk arkitektur. Detta är kanske bäst exemplifieras av de många konvergent dragen i gymnotiforms och mormyrids, två arter-rika benfisk klader som producerar och upptäcka svaga elektriska fält och kallas svagt elektrisk fisk. Under 50 år sedan upptäckten att svagt elektrisk fisk använder el för att känna sin omgivning och kommunicera, en växande gemenskap av forskare har fått enorma insikter i utvecklingen av utveckling, system och kretsar neurovetenskap, cellulär fysiologi, ekologi, evolutionsbiologi och beteende. På senare tid har det skett en spridning av genomiska resurser för elektrisk fisk. Användningen av dessa resurser har redan underlättat viktiga insikter när det gäller sambandet mellan genotyp och fenotyp hos dessa arter. Ett stort hinder för att integrera genomik-data med fenotypiska data av svagt elektrisk fisk är en närvarande brist på funktionella genomik-verktyg. Vi rapporterar här ett fullständigt protokoll för att utföra CRISPR/Cas9 mutagenes som utnyttjar endogena DNA-reparationsmekanismer i svagt elektrisk fisk. Vi visar att detta protokoll är lika effektivt i både den mormyryd arten brienomyrus brachyistius och gymnotiform brachyhypopomus gauderio genom att använda CRISPR/Cas9 för att rikta indels och punktmutationer i den första exon av natrium kanal gen scn4aa. Med detta protokoll erhölls embryon från båda arterna och genotypades för att bekräfta att de förutspådda mutationerna i den första exon av natrium kanalen scn4aa var närvarande. Den knock-out framgång fenotyp bekräftades med inspelningar som visar minskade elektriska organ urladdnings amplituder jämfört med uninjected storlek matchade kontroller.
Introduction
Electroreception och electrogenesis har förändrats i den evolutionära historien av ryggradsdjur. Två linjer av benfisk fisk, artikel fiskar och Siluriformes, utvecklades elektromottagning parallellt, och fem linjer av fiskar (Gymnotiformes, mormyrids, och släktena astroscopus, Malapterurus och Synodontis) utvecklades elektrogenes parallellt. Det finns en slående grad av konvergens i dessa oberoende härledda fenotyper, som delar en gemensam genetisk arkitektur1,2,3.
Detta är kanske bäst exemplifieras av de många konvergent dragen i gymnotiforms och mormyrids, två artrika benfisk klader, som producerar och upptäcka svaga elektriska fält och kallas svagt elektrisk fisk. Under de 50 år sedan upptäckten att svagt elektrisk fisk använder elektricitet för att känna sin omgivning och kommunicera4, en växande gemenskap av forskare har fått enorma insikter i utvecklingen av utvecklingen1,5 ,6, system och kretsar neurovetenskap7,8,9,10, cellulär fysiologi11,12, ekologi och energetik13 ,14,15,16,17, beteende18,19och makro evolution3,20,21 .
På senare tid har det skett en spridning av genomiska, transkriptomiska och proteomiska resurser för elfisk1,22,23,24,25,26, 27,28. Användningen av dessa resurser har redan gett viktiga insikter om sambandet mellan genotyp och fenotyp hos dessa arter1,2,3,28,29 ,30. Ett stort hinder för att integrera genomik-data med fenotypiska data av svagt elektrisk fisk är en närvarande brist på funktionella genomiska verktyg31.
Ett sådant verktyg är den nyligen utvecklade klustrade regelbundet Interfördelade korta Palindromic repetitioner paras ihop med Cas9 Endonuklease (CRISPR/Cas9, CRISPR) teknik. CRISPR/Cas9 är ett genomredigeringsverktyg som har gått in i utbredd användning i både modell32,33,34 och icke-modellorganismer35,36,37 lika. CRISPR/Cas9-tekniken har utvecklats till en punkt där ett laboratorium som kan grundläggande molekylärbiologi enkelt ska kunna generera genspecifika sonder som kallas Short guide RNAs (sgRNAs), till en låg kostnad med en icke-kloningsmetod38. CRISPR har fördelar jämfört med andra knockout/knockdown strategier, såsom morpholinos39,40, transkription Activator-liknande effektor nukleaser (talens), och zink finger nukleaser (zfns), som är kostsamma och tidskrävande att generera för varje målgen.
CRISPR/Cas9-systemet fungerar för att skapa genknockouts genom att rikta in sig på en specifik region i arvsmassan, regisserad av sgRNA-sekvensen, och orsaka en dubbel-strandad rast. Den dubbelsträngade rasten upptäcks av cellen och utlöser endogena DNA-reparationsmekanismer företrädesvis med hjälp av den icke-homolog sammanfogning (NHEJ) vägen. Denna väg är mycket felbenägna: Under reparationsprocessen kommer DNA-molekylen ofta införliva infogningar eller borttagningar (indels) på den dubbelsträngade rastplatsen. Dessa indels kan resultera i en förlust av funktion på grund av antingen (1) förskjutningar i den öppna Läs ramen, (2) införande av en för tidig stopp kodon, eller (3) förskjutningar i den kritiska primära strukturen av genprodukten. I detta protokoll använder vi CRISPR/Cas9 redigering för att rikta punktmutationer i målgener med hjälp av NHEJ i svagt elektriska fiskarter. Även om det är enklare och effektivare än andra tekniker förväntas denna metod för mutagenes resultera i en rad fenotypiska svårighetsgrader i F0, som tillskrivs genetisk mosaik41,42,43 ,44.
Val av organismer
För att underlätta framtida studier av den jämförande genomik av svagt elektrisk fisk, måste en representativ art för både gymnotiforms och mormyrids för protokoll utveckling väljas. Efter diskussioner under 2016 Electric Fish möte i Montevideo, Uruguay, det var gemenskap konsensus att utnyttja arter som redan kunde föds upp i laboratoriet och som hade genomiska resurser tillgängliga. Den gymnotiform brachyhypopomus gauderio och mormyryd brienomyrus brachyistius valdes som arter som passar dessa kriterier. I båda arterna är naturliga ledtrådar för att framkalla och bibehålla avels förhållanden lätt att efterlikna i fångenskap. B. gauderio, en gymnotiform arter från Sydamerika, har fördelen av låga djurhållning krav: fisk kan hållas på relativt hög densitet i relativt små (4 L) tankar. B. gauderio har också en snabb generations omsättning under företags förhållanden. Under laboratorieförhållanden kan B. gauderio utvecklas från ägg till vuxen i ca 4 månader.
B. brachyistius, en art av mormyryd fisk från väst-Centralafrika, häckar lätt i fångenskap. B. brachyistius är lätt tillgänglig genom akvarium handel, har använts i många studier, och nu har ett antal genomiska resurser tillgängliga. Deras livscykel spänner över 1 − 3 år, beroende på laboratorieförhållanden. Djurhållnings kraven är något intensivare för denna art, vilket kräver måttligt stora tankar (50 − 100 L) på grund av deras aggression under avel.
Laboratorier som studerar andra arter av elektrisk fisk bör lätt kunna anpassa detta protokoll så länge som arten kan uppfödas, och encelliga embryon kan samlas in och fostras till vuxen ålder. Bostäder, larv uppfödning och provrörsbefruktning (IVF) priser kommer sannolikt att förändras med andra arter; Detta protokoll kan dock användas som utgångspunkt för avels försök i andra svagt elektriska fiskar.
Ett ideal gen mål för proof of Concept: scn4aa
Svagt elektrisk mormyryd och gymnotiform fisk generera elektriska fält (electrogenesis) genom att fullgöra ett specialiserat organ, som kallas elektriska organ. Elektriska organ utsläpp (EODs) resultat från samtidig produktion av åtgärder potentialer i de elektriska organ celler som kallas elektrocyter. EODs upptäcks av en rad Elektroreceptorer i huden för att skapa högupplösta elektriska bilder av fiskens omgivning45. Svagt elektrisk fisk är också kapabla att upptäcka funktioner i deras conspecifics EOD vågformer18 samt deras utsläpp av46, vilket gör att EODS att fungera dessutom som en social kommunikation signal analogt med fågelsång eller groda vocalizations47.
En huvudsaklig del av åtgärden potentiell generation i elektrocyter av både mormyryd och gymnotiform svagt elektrisk fisk är spännings-gated natrium kanal nav 1.42. Icke-elektriska fiskar uttrycka två paralogous genkopior, scn4aa och scn4ab, kodning för spännings-gated natrium Channel nav 1.430. I både gymnotiform och mormyryd svagt elektrisk fisk linjer, scn4aa har utvecklats snabbt och genomgått många aminosyran substitutioner som påverkar dess Kinetic egenskaper48. Viktigast av allt, scn4aa har blivit uppdelade i båda linjerna till den elektriska orgel2,3. Det relativt begränsade uttrycket av scn4aa till den elektriska orgeln, liksom dess nyckelroll i generering av EODS, gör det till ett idealiskt mål för CRISPR/Cas9 knockout experiment, eftersom det har minimal skadliga pleiotrop effekter. Eftersom svagt elektrisk fisk börjar urladdning deras larv elektriska organ 6 − 8 dagar efter befruktning (DPF), inriktning av scn4aa är idealiskt lämpad för snabb fenotypning efter embryo mikroinjektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den fenotypiska rikedomen av svagt elektrisk fisk, tillsammans med en ny spridning av genomik resurser, motiverar ett starkt behov av funktionella genomiska verktyg i svagt elektrisk fisk modell. Detta system är särskilt attraktivt på grund av den konvergent utvecklingen av många fenotypiska drag i parallella linjer av fisk, som lätt hålls i laboratoriet.
Det protokoll som beskrivs här visar effekten av CRISPR/Cas9 teknik i linjer av svagt elektrisk fisk som utvecklats electrogenesis oc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner heroiska insatser av Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, och Hope Healey för hjälp med fisk hållning, datainsamling, och tidiga protokoll utveckling. Vi vill också tacka de tre granskarna för deras förslag till manuskriptet. Vi anser att slutprodukten är av bättre kvalitet efter att ha adressera deras kommentarer. Detta arbete finansierades genom stöd från National Science Foundation #1644965 och #1455405 till JRG, och Naturvetenskaps-och Ingenjörsvetenskaps rådet DG Grant till VLS.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
References
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
- Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system–twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
- Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
- Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
- Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
- Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
- Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
- Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
- Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
- Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
- Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
- Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
- Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
- Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
- Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
- Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
- Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
- Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
- Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
- Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
- Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
- Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
- Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
- Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
- Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
- Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
- Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
- Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
- Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
- Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
- Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
- Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. 발생학. 445 (2), 156-162 (2019).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. 발생학. 393 (1), 3-9 (2014).
- Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications. 유전학. 199 (1), 1-15 (2015).
- Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
- van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
- Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
- Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
- Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
- Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
- Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
- Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
- Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
