Här presenteras ett protokoll för att producera och bakre CRISPR/Cas9 Genome knockout elektrisk fisk. Beskrivs i detalj är de nödvändiga molekylära biologi, avel och djurhållning krav för både en gymnotiform och en mormyrid, och injektion tekniker för att producera Cas9-inducerad indel F0 larver.
Electroreception och electrogenesis har förändrats i den evolutionära historien av ryggradsdjur. Det finns en slående grad av konvergens i dessa oberoende härledda fenotyper, som delar en gemensam genetisk arkitektur. Detta är kanske bäst exemplifieras av de många konvergent dragen i gymnotiforms och mormyrids, två arter-rika benfisk klader som producerar och upptäcka svaga elektriska fält och kallas svagt elektrisk fisk. Under 50 år sedan upptäckten att svagt elektrisk fisk använder el för att känna sin omgivning och kommunicera, en växande gemenskap av forskare har fått enorma insikter i utvecklingen av utveckling, system och kretsar neurovetenskap, cellulär fysiologi, ekologi, evolutionsbiologi och beteende. På senare tid har det skett en spridning av genomiska resurser för elektrisk fisk. Användningen av dessa resurser har redan underlättat viktiga insikter när det gäller sambandet mellan genotyp och fenotyp hos dessa arter. Ett stort hinder för att integrera genomik-data med fenotypiska data av svagt elektrisk fisk är en närvarande brist på funktionella genomik-verktyg. Vi rapporterar här ett fullständigt protokoll för att utföra CRISPR/Cas9 mutagenes som utnyttjar endogena DNA-reparationsmekanismer i svagt elektrisk fisk. Vi visar att detta protokoll är lika effektivt i både den mormyryd arten brienomyrus brachyistius och gymnotiform brachyhypopomus gauderio genom att använda CRISPR/Cas9 för att rikta indels och punktmutationer i den första exon av natrium kanal gen scn4aa. Med detta protokoll erhölls embryon från båda arterna och genotypades för att bekräfta att de förutspådda mutationerna i den första exon av natrium kanalen scn4aa var närvarande. Den knock-out framgång fenotyp bekräftades med inspelningar som visar minskade elektriska organ urladdnings amplituder jämfört med uninjected storlek matchade kontroller.
Electroreception och electrogenesis har förändrats i den evolutionära historien av ryggradsdjur. Två linjer av benfisk fisk, artikel fiskar och Siluriformes, utvecklades elektromottagning parallellt, och fem linjer av fiskar (Gymnotiformes, mormyrids, och släktena astroscopus, Malapterurus och Synodontis) utvecklades elektrogenes parallellt. Det finns en slående grad av konvergens i dessa oberoende härledda fenotyper, som delar en gemensam genetisk arkitektur1,2,3.
Detta är kanske bäst exemplifieras av de många konvergent dragen i gymnotiforms och mormyrids, två artrika benfisk klader, som producerar och upptäcka svaga elektriska fält och kallas svagt elektrisk fisk. Under de 50 år sedan upptäckten att svagt elektrisk fisk använder elektricitet för att känna sin omgivning och kommunicera4, en växande gemenskap av forskare har fått enorma insikter i utvecklingen av utvecklingen1,5 ,6, system och kretsar neurovetenskap7,8,9,10, cellulär fysiologi11,12, ekologi och energetik13 ,14,15,16,17, beteende18,19och makro evolution3,20,21 .
På senare tid har det skett en spridning av genomiska, transkriptomiska och proteomiska resurser för elfisk1,22,23,24,25,26, 27,28. Användningen av dessa resurser har redan gett viktiga insikter om sambandet mellan genotyp och fenotyp hos dessa arter1,2,3,28,29 ,30. Ett stort hinder för att integrera genomik-data med fenotypiska data av svagt elektrisk fisk är en närvarande brist på funktionella genomiska verktyg31.
Ett sådant verktyg är den nyligen utvecklade klustrade regelbundet Interfördelade korta Palindromic repetitioner paras ihop med Cas9 Endonuklease (CRISPR/Cas9, CRISPR) teknik. CRISPR/Cas9 är ett genomredigeringsverktyg som har gått in i utbredd användning i både modell32,33,34 och icke-modellorganismer35,36,37 lika. CRISPR/Cas9-tekniken har utvecklats till en punkt där ett laboratorium som kan grundläggande molekylärbiologi enkelt ska kunna generera genspecifika sonder som kallas Short guide RNAs (sgRNAs), till en låg kostnad med en icke-kloningsmetod38. CRISPR har fördelar jämfört med andra knockout/knockdown strategier, såsom morpholinos39,40, transkription Activator-liknande effektor nukleaser (talens), och zink finger nukleaser (zfns), som är kostsamma och tidskrävande att generera för varje målgen.
CRISPR/Cas9-systemet fungerar för att skapa genknockouts genom att rikta in sig på en specifik region i arvsmassan, regisserad av sgRNA-sekvensen, och orsaka en dubbel-strandad rast. Den dubbelsträngade rasten upptäcks av cellen och utlöser endogena DNA-reparationsmekanismer företrädesvis med hjälp av den icke-homolog sammanfogning (NHEJ) vägen. Denna väg är mycket felbenägna: Under reparationsprocessen kommer DNA-molekylen ofta införliva infogningar eller borttagningar (indels) på den dubbelsträngade rastplatsen. Dessa indels kan resultera i en förlust av funktion på grund av antingen (1) förskjutningar i den öppna Läs ramen, (2) införande av en för tidig stopp kodon, eller (3) förskjutningar i den kritiska primära strukturen av genprodukten. I detta protokoll använder vi CRISPR/Cas9 redigering för att rikta punktmutationer i målgener med hjälp av NHEJ i svagt elektriska fiskarter. Även om det är enklare och effektivare än andra tekniker förväntas denna metod för mutagenes resultera i en rad fenotypiska svårighetsgrader i F0, som tillskrivs genetisk mosaik41,42,43 ,44.
Val av organismer
För att underlätta framtida studier av den jämförande genomik av svagt elektrisk fisk, måste en representativ art för både gymnotiforms och mormyrids för protokoll utveckling väljas. Efter diskussioner under 2016 Electric Fish möte i Montevideo, Uruguay, det var gemenskap konsensus att utnyttja arter som redan kunde föds upp i laboratoriet och som hade genomiska resurser tillgängliga. Den gymnotiform brachyhypopomus gauderio och mormyryd brienomyrus brachyistius valdes som arter som passar dessa kriterier. I båda arterna är naturliga ledtrådar för att framkalla och bibehålla avels förhållanden lätt att efterlikna i fångenskap. B. gauderio, en gymnotiform arter från Sydamerika, har fördelen av låga djurhållning krav: fisk kan hållas på relativt hög densitet i relativt små (4 L) tankar. B. gauderio har också en snabb generations omsättning under företags förhållanden. Under laboratorieförhållanden kan B. gauderio utvecklas från ägg till vuxen i ca 4 månader.
B. brachyistius, en art av mormyryd fisk från väst-Centralafrika, häckar lätt i fångenskap. B. brachyistius är lätt tillgänglig genom akvarium handel, har använts i många studier, och nu har ett antal genomiska resurser tillgängliga. Deras livscykel spänner över 1 − 3 år, beroende på laboratorieförhållanden. Djurhållnings kraven är något intensivare för denna art, vilket kräver måttligt stora tankar (50 − 100 L) på grund av deras aggression under avel.
Laboratorier som studerar andra arter av elektrisk fisk bör lätt kunna anpassa detta protokoll så länge som arten kan uppfödas, och encelliga embryon kan samlas in och fostras till vuxen ålder. Bostäder, larv uppfödning och provrörsbefruktning (IVF) priser kommer sannolikt att förändras med andra arter; Detta protokoll kan dock användas som utgångspunkt för avels försök i andra svagt elektriska fiskar.
Ett ideal gen mål för proof of Concept: scn4aa
Svagt elektrisk mormyryd och gymnotiform fisk generera elektriska fält (electrogenesis) genom att fullgöra ett specialiserat organ, som kallas elektriska organ. Elektriska organ utsläpp (EODs) resultat från samtidig produktion av åtgärder potentialer i de elektriska organ celler som kallas elektrocyter. EODs upptäcks av en rad Elektroreceptorer i huden för att skapa högupplösta elektriska bilder av fiskens omgivning45. Svagt elektrisk fisk är också kapabla att upptäcka funktioner i deras conspecifics EOD vågformer18 samt deras utsläpp av46, vilket gör att EODS att fungera dessutom som en social kommunikation signal analogt med fågelsång eller groda vocalizations47.
En huvudsaklig del av åtgärden potentiell generation i elektrocyter av både mormyryd och gymnotiform svagt elektrisk fisk är spännings-gated natrium kanal nav 1.42. Icke-elektriska fiskar uttrycka två paralogous genkopior, scn4aa och scn4ab, kodning för spännings-gated natrium Channel nav 1.430. I både gymnotiform och mormyryd svagt elektrisk fisk linjer, scn4aa har utvecklats snabbt och genomgått många aminosyran substitutioner som påverkar dess Kinetic egenskaper48. Viktigast av allt, scn4aa har blivit uppdelade i båda linjerna till den elektriska orgel2,3. Det relativt begränsade uttrycket av scn4aa till den elektriska orgeln, liksom dess nyckelroll i generering av EODS, gör det till ett idealiskt mål för CRISPR/Cas9 knockout experiment, eftersom det har minimal skadliga pleiotrop effekter. Eftersom svagt elektrisk fisk börjar urladdning deras larv elektriska organ 6 − 8 dagar efter befruktning (DPF), inriktning av scn4aa är idealiskt lämpad för snabb fenotypning efter embryo mikroinjektion.
Den fenotypiska rikedomen av svagt elektrisk fisk, tillsammans med en ny spridning av genomik resurser, motiverar ett starkt behov av funktionella genomiska verktyg i svagt elektrisk fisk modell. Detta system är särskilt attraktivt på grund av den konvergent utvecklingen av många fenotypiska drag i parallella linjer av fisk, som lätt hålls i laboratoriet.
Det protokoll som beskrivs här visar effekten av CRISPR/Cas9 teknik i linjer av svagt elektrisk fisk som utvecklats electrogenesis oc…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner heroiska insatser av Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, och Hope Healey för hjälp med fisk hållning, datainsamling, och tidiga protokoll utveckling. Vi vill också tacka de tre granskarna för deras förslag till manuskriptet. Vi anser att slutprodukten är av bättre kvalitet efter att ha adressera deras kommentarer. Detta arbete finansierades genom stöd från National Science Foundation #1644965 och #1455405 till JRG, och Naturvetenskaps-och Ingenjörsvetenskaps rådet DG Grant till VLS.
20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |