Transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec Ralstonia Solanacearum pour l’analyse génétique directe de la maladie bactérienne de wilt
Summary
Ici, nous présentons une méthode polyvalente pour la transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec Ralstonia solanacearum pour effectuer l’analyse génétique simple pour l’étude de la maladie bactérienne de flétrir.
Abstract
Ralstonia solanacearum est un agent pathogène vasculaire dévastateur transmis par le sol qui peut infecter un large éventail d’espèces végétales, ce qui constitue une menace importante pour l’agriculture. Cependant, le modèle Ralstonia est considérablement sous-exploré par rapport à d’autres modèles impliquant des pathogènes végétaux bactériens, tels que les seringues Pseudomonas dans Arabidopsis. La recherche visant à comprendre l’interaction entre Ralstonia et les plantes cultivées est essentielle pour développer des solutions durables pour lutter contre la flétrie bactérienne, mais elle est actuellement entravée par l’absence d’essais expérimentaux simples pour caractériser les différentes composantes de l’interaction dans les plantes hôtes indigènes. Dans ce scénario, nous avons développé une méthode pour effectuer l’analyse génétique de l’infection Ralstonia de la tomate, un hôte naturel de Ralstonia. Cette méthode est basée sur Agrobacterium rhizogenes– transformation médiatisée des racines de tomate, suivie par l’inoculation du sol Ralstonia des plantes résultantes, contenant des racines transformées exprimant la construction de l’intérêt. La polyvalence de l’essai de transformation des racines permet d’effectuer soit la surexpression génétique ou le silençage génétique médié par les ARNi. Comme preuve de concept, nous avons utilisé cette méthode pour montrer que le silence par médiation RNAi de SlCESA6 dans les racines de tomate confère une résistance à Ralstonia. Ici, nous décrivons cette méthode en détail, permettant aux approches génétiques de comprendre la maladie bactérienne de flétrissement dans un temps relativement court et avec de petites exigences de l’équipement et de l’espace de croissance des plantes.
Introduction
Ralstonia solanacearum, l’agent causal de la maladie bactérienne de flétrissement, est un agent pathogène vasculaire dévastateur transmis par le sol avec une distribution mondiale qui peut infecter une grande gamme d’espèces végétales, y compris la pomme de terre, la tomate, le tabac, la banane, le poivre et l’aubergine, entre autres1,2. Les pertes de rendement causées par Ralstonia peuvent atteindre 80-90% de la production de tomates, de pommes de terre ou de bananes, selon le cultivar, le climat, le sol et d’autres facteurs3. Cependant, le modèle Ralstonia est considérablement sous-exploré par rapport à d’autres modèles impliquant des pathogènes végétaux bactériens, tels que pseudomonas syringae ou Xanthomonas spp. En outre, la plupart des études sur les interactions plantes-microbe sont axées sur la plante modèle Arabidopsis thaliana. Bien que la recherche utilisant ces modèles ait largement contribué à notre compréhension des interactions plante-bactérie, elles ne répondent pas à la nécessité actuelle de comprendre ces interactions dans les plantes cultivées. La recherche visant à comprendre l’interaction entre Ralstonia et les plantes cultivées est essentielle pour développer des solutions durables pour lutter contre la flétrie bactérienne, mais elle est actuellement entravée par l’absence d’essais expérimentaux simples pour caractériser les différentes composantes de l’interaction. En particulier, la tomate, un hôte naturel pour Ralstonia, est la deuxième culture végétale la plus importante dans le monde et est affectée par une pléthore de maladies4, y compris la maladie bactérienne de flétrissement. Dans ce travail, nous avons développé une méthode facile pour effectuer l’analyse génétique de l’infection de Ralstonia de la tomate. Cette méthode est basée sur Agrobacterium rhizogenes-transformation négociée des racines de tomate, en utilisant la fluorescence DsRed comme marqueur de sélection5, suivie par l’inoculation du sol Ralstonia des plantes résultantes, contenant des racines transformées exprimant la construction de l’intérêt. La polyvalence de l’essai de transformation des racines permet d’effectuer soit la surexpression génétique ou le silençage génétique médié par les ARNi.
Une limitation potentielle de cette méthode consiste en la croissance résiduelle des racines non transformées. Ceci est particulièrement important dans les cas où le plasmide utilisé n’a pas de gène reporter qui permet la sélection des racines transformées. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode alternative basée sur la sélection des antibiotiques, qui inhibe la croissance de racines non transformées tout en permettant la croissance de racines transformées résistantes aux antibiotiques saines. Étant donné que A. rhizogenes n’induit pas la transformation des pousses, ils sont sensibles à l’antibiotique, et, par conséquent, ils doivent être tenus séparés du milieu antibiotique contenant.
Bien que la résistance des plantes contre Ralstonia ne soit pas bien comprise, plusieurs rapports ont associé des altérations de la paroi cellulaire à une résistance accrue au flétrissement bactérien6,7,8,9. Il a été suggéré que ces altérations de mur cellulaire affectent le développement vasculaire, un aspect essentiel pour le mode de vie de Ralstonia à l’intérieur de la plante10. Les mutations dans les gènes codant les synthases de cellulose CESA4, CESA7 et CESA8 dans Arabidopsis thaliana ont été montrés pour altérer l’intégrité secondaire de mur de cellules, causant une résistance accrue à Ralstonia, qui semble être liée à la signalisation ABA8. Par conséquent, comme une preuve de concept pour notre méthode, nous avons effectué le silençage génétique RNAi-négocié de SlCESA6 (Solyc02g072240), une synthase de cellulose cellule-mur secondaire secondaire, et orthologue de AtCESA8 (At4g18780). L’inoculation subséquente de sol-drenching avec Ralstonia a prouvé que le silence SlCESA6 a augmenté la résistance aux symptômes bactériens de flétrissement, suggérant que la résistance mur-négociée de cellules à Ralstonia est probablement conservée dans la tomate, et validant notre méthode pour effectuer l’analyse génétique de la résistance bactérienne de flétrie dans les racines de tomate. Ici, nous décrivons cette méthode en détail, permettant aux approches génétiques de comprendre la maladie bactérienne de flétrissement dans un temps relativement court et avec de petites exigences de l’équipement et de l’espace de croissance des plantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum représente une menace importante pour l’agriculture; cependant, son interaction avec les hôtes naturels d’importance agricole est encore mal comprise par rapport à d’autres agents pathogènes bactériens, en particulier chez les espèces végétales. Dans la plupart des cas, l’analyse génétique est entravée par le temps et les dépenses nécessaires pour modifier génétiquement les plantes hôtes. Pour résoudre ce problème et faciliter l’analyse génétique de l’infect…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les membres du laboratoire Macho pour des discussions utiles, Alvaro Lopez-Garcia pour des conseils statistiques, et Xinyu Jian pour l’assistance technique et administrative pendant ce travail. Nous remercions l’installation de base de biologie cellulaire de la CFP pour son aide à l’imagerie par fluorescence Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche prioritaire stratégique de l’Académie chinoise des sciences (subvention XDB27040204), le Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinois) Académie des sciences) et le programme chinois 1000 Talents.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
References
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
