역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화
Summary
여기에서, 우리는 무세포 단백질 합성 반응에 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 제시합니다. 무세포 합성 혼합물은 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 효과적인 분리를 위해 아일린으로 유도한 다음 동위원소로 표시된 내부 표준을 사용하여 질량 분석법에 의해 정량화됩니다.
Abstract
무세포 단백질 합성(CFPS)은 체외 단백질 생산을 위한 시스템 및 합성 생물학의 새로운 기술입니다. 그러나 CFPS가 실험실을 넘어 제때 제조 기술에 대한 광범위하고 표준이 될 경우 이러한 시스템의 성능 한계를 이해해야 합니다. 이 질문으로, 우리는 GLYCOlysis, 펜토오스 인산 통로, 삼차 질산 주기, 에너지 대사 및 CFPS 반응에 있는 동료 회생에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 13C-aniline으로 태그가 지정된 내부 표준을 사용하는 반면 샘플의 화합물은 12C-aniline으로파생됩니다. 내부 표준 및 샘플을 역상 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC/MS)에 의해 혼합 및 분석하였다. 화합물의 공동 용출은 이온 억제를 제거하여 평균 상관 계수가 0.988인 2-3배 이상의 대사산물 농도를 정확하게 정량화할 수 있습니다. 40개의 화합물 중 5개는 아니라인으로 태그가 지정되지 않았지만, CFPS 샘플에서 여전히 검출되고 표준 곡선 방법으로 정량화되었습니다. 크로마토그래피 실행을 완료하는 데 약 10분이 걸립니다. 종합하면, 우리는 단일 LC/MS 실행에서 CFPS에 관련된 40개의 화합물을 분리하고 정확하게 정량화하는 빠르고 견고한 방법을 개발했습니다. 이 방법은 무세포 신진 대사를 특성화하는 포괄적이고 정확한 접근법으로 궁극적으로 무세포 시스템의 수율, 생산성 및 에너지 효율을 이해하고 향상시킬 수 있습니다.
Introduction
무세포 단백질 합성(CFPS)은 단백질과 화학 물질의 제조를 위한 유망한 플랫폼으로, 전통적으로 살아있는 세포를 위해 예약되어 있는 응용 프로그램입니다. 무세포 시스템은 조세포 추출물에서 유래하고 세포 성장과 관련된 합병증을제거1. 또한 CFPS는 세포벽의 간섭 없이 대사산물 및 생합성 기계에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 그러나, 무세포 프로세스의 성능 한계에 대한 근본적인 이해는 부족했습니다. 대사 산물 정량화를위한 높은 처리량 방법은 신진 대사의 특성화에 유용하며 대사 전산 모델2,3,4의구성에 중요합니다. 대사 산물 농도를 결정하는 데 사용되는 일반적인 방법은 핵 자기 공명 (NMR), 푸리에 변환 적외선 분광법 (FT-IR), 효소 기반 분석 및 질량 분광법 (MS)5,6,7을포함합니다 ,8. 그러나, 이러한 방법은 종종 한 번에 여러 화합물을 효율적으로 측정할 수 없기 때문에 제한되며 종종 일반적인 무세포 반응보다 더 큰 샘플 크기를 필요로 합니다. 예를 들어, 효소 기반 세포는 종종 실행에서 단일 화합물을 정량화하는 데만 사용될 수 있으며, 세포없는 단백질 합성 반응과 같이 샘플 크기가 작을 때 제한됩니다 (전형적으로 10-15 μL 척도에서 실행). 한편, NMR검출 및 정량화를 위해 대사산물의 풍부도가 요구된다5. 이러한 단점을 향해, 질량 분석법 (LC / MS)와 함께 크로마토그래피 방법은 높은 감도 및 동시에 여러 종을 측정하는 기능을 포함하여 여러 장점을 제공합니다9; 그러나 분석 복잡성은 측정되는 종의 수와 다양성에 따라 상당히 증가합니다. 따라서 LC/MS 시스템의 높은 처리량 잠재력을 완전히 실현하는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 견본에 있는 화합물은 액체 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법을 통해 확인됩니다. 화합물의 신호는 이온화가 화합물 마다 다를 수 있고 또한 견본 매트릭스에 따라 달라질 수 있는 그것의 집중 그리고 이온화 효율성에 달려 있습니다.
LC/MS를 사용하여 시료와 표준 간에 동일한 이온화 효율을 달성하는 것은 어려운 과제입니다. 또한, 양성자 친화성 및극성(10)에서신호 분할 및 이질성으로 인한 대사 산물 다양성으로 정량화는 더욱 어려워진다. 마지막으로, 샘플의 공동 용출 매트릭스는 또한 화합물의 이온화 효율에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 대사 산물은 화학적으로 유도 될 수있다, LC / MS 시스템에 의해 분리 분해 및 감도를 증가, 동시에 어떤 경우에는 신호 분할을 감소하면서10,11. 화학적 유도체화는 대사산물의 특정 작용기를 태그하여 전하 또는 소수성 등의 물성을 조절하여 이온화 효율을 증가시킴으로써 작동한다11. 다양한 태깅 제제는 상이한 작용기(예를 들어, 아민, 하이드록실, 인산염, 카르복실산 등)를 표적으로 하는데 사용될 수 있다. 이러한 파생화 제중 하나인 Aniline은 한 번에 여러 작용체를 대상으로 하고 소수성 성분을 친수성 분자에 추가하여 분리 분해능 및신호(12)를증가시다. 공동 용출 매트릭스 이온 억제 효과를 해결하기 위해 Yang과 동료들은 표준에 13C이실린 동위원소와 태그를 지정하고 샘플과 혼합하는 그룹 별 내부 표준 기술(GSIST) 라벨링에 기반한 기술을 개발했습니다. 12,13. 대사 산물 및 해당 내부 표준은 공동 용해되기 때문에 동일한 이온화 효율을 가지며, 그들의 강도 비는 실험 샘플의 농도를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.
이 연구에서는, 우리는 CFPS 반응에 있는 glycolysis, 펜토오스 인산 통로, tricarboxylic 산 주기, 에너지 물질 대사 및 동료 회생에 관련시킨 40의 화합물을 검출하고 정량화하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 역위상 LC/MS를 사용하여 대사 산물에 태그, 감지 및 정량화하기 위해 12C-aniline 및 13C-aniline을 사용한 GSIST 접근 방식을 기반으로 합니다. 모든 화합물의 선형 범위는 평균 상관 계수 0.988을 가진 크기의 2-3 순서에 걸쳐 있습니다. 따라서, 이 방법은 무세포 대사, 그리고 아마도 전체 세포 추출물을 심문하는 강력하고 정확한 접근법이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
무세포 시스템에는 세포벽이 없으므로 복잡한 시료 전처리없이 대사산물과 생합성 기계에 직접 접근할 수 있습니다. 그러나 세포 없는 반응 시스템을 정량적으로 심문하기 위한 철저하고 견고한 프로토콜을 개발하기 위한 작업은 거의 이루어지지 않았습니다. 이 연구에서는 무세포 반응 혼합물과 잠재적으로 전세포 추출물에서 대사 산물을 정량화하는 빠르고 강력한 방법을 개발했습니다. 세포…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술된 일은 국립 암 학회 (https://www.cancer.gov/)에서 수상 번호 1U54CA210184-01을 통해 암 물질 대사의 물리학에 센터에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
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