Децентрализованная (Ex Vivo) модель мочевого пузыря с детрусорной мышцей удалены для прямого доступа к suburothelium во время заполнения мочевого пузыря
Summary
Модель мочевого пузыря, свободная от детрузозора, обеспечивает прямой доступ к субуротелию для изучения местных механизмов регулирования наличия биологически активного посредника в субуротелии/ламине проприи и опорожнение мочи. Препарат очень напоминает заполнение нетронутого мочевого пузыря и позволяет проводить исследования по объему давления без системного воздействия.
Abstract
Предыдущие исследования установили высвобождение химических веществ из листов слизистой оболочки плоского пузыря, прикрепленных в усинг-камерах и подверженных изменениям гидростатического давления или механического растяжения, а также из культивированных уротических клеток при гидростатических изменениях давления, растяжения, отеке клеток или сил перетаскивания, а также в просвете мочевого пузыря в конце заполнения. Такие выводы привели к предположению, что эти посредники также высвобождаются в субуротелиум (SubU)/lamina propria (LP) во время заполнения мочевого пузыря, где они влияют на клетки глубоко в стенке мочевого пузыря, чтобы в конечном счете регулировать возбудимость мочевого пузыря. В таких исследованиях есть по крайней мере два очевидных ограничения: 1) ни один из этих подходов не дает прямой информации о присутствии посредников в SubU/LP, и 2) используемые стимулы не являются физиологическими и не поддаются подлинному наполнению мочевого пузыря. Здесь мы обсуждаем процедуру, которая позволяет прямой доступ к субротелиальной поверхности слизистой оболочки мочевого пузыря в процессе заполнения мочевого пузыря. Препарат без минурного детрузора, который мы создали, очень напоминает заполнение нетронутого мочевого пузыря и позволяет проводить исследования по объему давления на мочевом пузыре при отсутствии путаницы, сигнализирующей от спинальных рефлексов и гладкой мышцы. Используя новую модель мочевого пузыря без детрузора, мы недавно продемонстрировали, что внутривежные измерения посредников не могут быть использованы в качестве прокси-сервера к тому, что было выпущено или присутствует в SubU/LP во время заполнения мочевого пузыря. Модель позволяет изучить уротелий полученных сигнальных молекул, которые высвобождаются, генерируются метаболизмом и / или транспортируются в SubU / LP в ходе заполнения мочевого пузыря для передачи информации в нейроны и гладкой мышцы мочевого пузыря и регулировать его возбудимость во время недержания и micturition.
Introduction
Цель этой модели заключается в том, чтобы обеспечить прямой доступ к подмукозной стороне слизистой оболочки мочевого пузыря во время различных фаз заполнения мочевого пузыря.
Мочевой пузырь должен воздерживаться от преждевременного сокращения во время заполнения и пустой, когда критический объем и давление достигаются. Аномальные недержания или аннулирования мочи часто связаны с ненормальной возбудимостью детрузор гладкой мышцы (DSM) в ходе заполнения мочевого пузыря. Возбудимость DSM определяется факторами, присущими гладким мышечным клеткам, и влияниями, генерируемыми различными типами клеток в стенке мочевого пузыря. Стенка мочевого пузыря состоит из уротелия (слизистая оболочка), субуротелия (SubU)/lamina propria (LP), детрузора гладкой мышцы (DSM) и серозы(рисунок 1A). Уротелий состоит из зонтичных клеток (т.е. внешнего слоя уротелия), промежуточных клеток и базальных клеток (т.е. внутреннего слоя уротелия). Различные типы клеток, в том числе интерстициальные клетки, фибробласты, афферентные нервные терминалы, мелкие кровеносные сосуды и иммунные клетки находятся в SubU/LP. Широко предполагается, что уротелиум мочевого пузыря является сенсорным органом, который инициирует рефлекс micturition и недержание инфекции, выпуская посредников в субмукозы, которые влияют на клетки в SubU / LP и DSM1,2,3. По большей части, такие предположения основаны на исследованиях, которые продемонстрировали высвобождение посредников: из кусочков слизистой оболочки подвергаются изменениям гидростатического давления4,5; от культурных уротелиальных клеток подвергаются растяжения6,7, гипотониность индуцированной клеточной опухоль7 или перетащить силы8; от изолированных полоски стенки мочевого пузыря на рецепторе или активации нерва9,10,11,12,13,14; и в просвет мочевого пузыря в конце мочевого пузыря заполнения15,16,17,18,19. Хотя такие исследования сыграли важную роль, чтобы продемонстрировать освобождение посредников при механической стимуляции сегментов стенки мочевого пузыря или культивируемых уротелиальных клеток, они должны быть подкреплены прямыми доказательствами для освобождения посредников в субмукозе, которая вызывается физиологическими стимулами, которые воспроизводят наполнение мочевого пузыря. Это сложная задача, учитывая, что SubU / LP находится глубоко в стенке мочевого пузыря препятствует простой доступ к окрестностям SubU / LP во время заполнения мочевого пузыря.
Здесь мы иллюстрируем децентрализованную (ex vivo) модель мочевого пузыря с детрусорной мышцей удалены13, которая была разработана для облегчения исследований на местных механизмов механотрансдукции, которые участвуют в сигнализации между мочевого пузыря уротели, DSM и других типов клеток в стенке мочевого пузыря. Этот подход превосходит использование плоских листов стенки мочевого пузыря, полосы стенки мочевого пузыря или культивированные уротелиальные клетки, потому что он позволяет прямые измерения в непосредственной близости от SubU / LP уротелия полученных посредников, которые высвобождаются или формируются в ответ на физиологические давления и объемы в мочевом пузыре и позволяет избежать потенциальных фенотипических изменений в культуре клеток. Он может быть использован для измерения доступности, выпуска, метаболизма и трансуротелиальной транспортировки посредников в SubU/LP на разных стадиях заполнения мочевого пузыря(рисунок 1B). Препарат также может быть использован для изучения уротелилиальной сигнализации и механотрансдукции в моделях гиперактивных и недостаточно активных синдромов мочевого пузыря.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мочевой пузырь имеет две функции: хранение и аннулирование мочи. Нормальная работа этих функций требует надлежащего механического зондирования внутрилюмительного объема и давления и трансдукции сигналов через клетки в стенке мочевого пузыря для регулирования возбуждания мышц детру…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и почек Грант DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
References
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes–a possible sensory mechanism?. Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
