用于大鼠圆周食管重建的组织工程移植
Summary
食管重建是一个具有挑战性的过程，开发一个组织工程食道，使食管粘组织和肌肉再生，可以植入人工移植是必要的。在这里，我们提出我们的协议，以生成人工食道，包括脚手架制造，生物反应器培养，和各种手术技术。
Abstract
在大鼠中，使用生物相容材料进行圆食管重建是一项技术上具有挑战性的任务，需要具有营养支持的最佳植入技术。近年来，食管组织工程尝试多次，但由于在蠕动特殊环境下早期上皮的难度，成功率有限。在这里，我们开发了一种人工食道，通过双层管状支架、基于间质干细胞的生物反应器系统和经过改良的旁路喂养技术，可以改善食管粘膜和肌肉层的再生。胃切除术。支架由聚氨酯 （PU） 纳米纤维制成，呈圆柱形，外壁缠绕为三维 （3D） 印刷聚苯乙烯链。在移植之前，将人类衍生的等位干细胞播种到脚手架的流明中，并进行了生物反应器培养，以提高细胞反应能力。我们通过应用手术麻醉术和用甲状腺皮瓣覆盖植入的假肢，然后进行临时非口腔胃切除喂养，提高了移植存活率。这些移植物能够重述植入部位周围初始上皮和肌肉再生的发现，组织学分析证明了这一点。此外，在移植物的外围观察到增加的乳化纤维和新血管化。因此，该模型提出了一种潜在的圆食管重建新技术。
Introduction
食管疾病的治疗，如先天性畸形和食管癌，可导致食道的结构部分损失。在大多数情况下，自体置换移植物，如胃上拉导管或结肠插合，已执行1，2。然而，这些食管置换物有各种手术并发症和再手术风险3。因此，使用组织工程食道支架模仿原生食道可以是一个有前途的替代策略，最终再生丢失的组织4，5，6。
尽管组织工程食道可能为目前食管缺陷的治疗提供替代方案，但其体内应用存在重大障碍。术后麻醉性渗漏和植入的食管支架坏死不可避免地导致周围无菌空间的致命感染，如中管7。因此，防止伤口和鼻胃管中的食物或唾液污染是非常重要的。胃切除术或静脉营养应考虑，直到主要伤口愈合完成。迄今为止，食管组织工程已经在大型动物模型中进行，因为大型动物在植入脚手架8后，只能通过静脉过度过敏喂养2-4周。然而，这种非口腔喂养模式尚未建立，以在小动物食管移植后的早期生存。这是因为动物非常活跃，无法控制，所以他们不能长时间把喂食管放在胃里。因此，在小型动物中成功进行食管移植的案例很少。
针对食管组织工程的情况，设计了由电旋纳米纤维（内层;图1A）和3D打印链（外层;图1B）包括经过改良的胃切除术技术。内部纳米纤维由PU（一种不可降解的聚合物）制成，可防止食物和唾液泄漏。外部 3D 打印链由可生物降解的多氯酰氨酰氨铁 （PCL） 制成，可提供机械灵活性并适应蠕动运动。人类脂肪衍生的等位干细胞（hAD-MSCs）被播种在支架的内层，以促进再表皮化。纳米纤维结构可为细胞迁移提供结构细胞外基质（ECM）环境，从而促进初始粘膜再生。
我们还通过生物反应器培养提高了接种细胞的存活率和生物活性。植入的脚手架覆盖甲状腺皮瓣，使食管粘和肌肉层更稳定地再生。在本报告中，我们描述了食管组织工程技术的协议，包括脚手架制造、基于中生干细胞的生物反应器培养、带改性胃切除术的旁路喂养技术以及经过改造的外科手术大鼠模型中圆周食管重建的麻醉技术。
Protocol
Representative Results
Discussion
现有的人工食道动物研究仍然受到几个关键因素的限制。理想的人工食管支架应具有生物相容性，具有优异的物理性能。它应该能够在术后早期再生粘膜上皮，以防止麻醉性渗漏。内圆形和外纵向肌肉层的再生对于功能蠕动12、13也很重要。
食道的机械特性是必不可少的，因为食道在呼吸过程中崩溃，在吞咽过程中打开，不断接触?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了韩国卫生技术研发项目的支持，该项目由韩国卫生福利部资助，由大韩民国卫生福利部资助（赠款号：HI16C0362）和基础科学研究通过由教育部资助的韩国国家研究基金会（NRF）计划（2017R1C1B2011132）。这项研究中使用的生物标本和数据由韩国生物银行网络成员首尔国立大学医院生物库提供。
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
