Tissue-Engineered Graft voor circumferential slokdarmreconstructie bij ratten
Summary
Slokdarmreconstructie is een uitdagende procedure, en de ontwikkeling van een weefsel-engineered slokdarm die regeneratie van slokdarmslijmvlies en spier mogelijk maakt en die kan worden geïmplanteerd als een kunstmatige graft is noodzakelijk. Hier presenteren we ons protocol om een kunstmatige slokdarm te genereren, inclusief steigerproductie, bioreactorteelt en verschillende chirurgische technieken.
Abstract
Het gebruik van biocompatibele materialen voor circumferential eesofagereconstructie is een technisch uitdagende taak bij ratten en vereist een optimale implantaattechniek met voedingsondersteuning. Onlangs zijn er vele pogingen tot slokdarmweefsel engineering, maar het slagingspercentage is beperkt als gevolg van moeilijkheden in de vroege epithelisatie in de speciale omgeving van peristalis. Hier ontwikkelden we een kunstmatige slokdarm die de regeneratie van het slokdarmslijmvlies en spierlagen kan verbeteren door middel van een tweelaags buisvormig schavot, een mesenchymale stamcelgebaseerd bioreactorsysteem en een bypassvoedingtechniek met aangepaste Gastrostomy. Het schavot is gemaakt van polyurethaan (PU) nanovezels in een cilindrische vorm met een driedimensionale (3D) geprinte polycaprolactone streng gewikkeld rond de buitenmuur. Voorafgaand aan de transplantatie werden mesenchymale stamcellen van menselijke afkomst in het lumen van het schavot gezaaid en werd de bioreactorteelt uitgevoerd om de cellulaire reactiviteit te verbeteren. We verbeterden de overlevingsgraad van graft door chirurgische anastomose toe te passen en de geïmplanteerde prothese te bedekken met een schildklierflap, gevolgd door tijdelijke nonorale gastrostomievoeding. Deze grafts waren in staat om de bevindingen van de eerste epitheelalisatie en spierregeneratie rond de geïmplanteerde sites, zoals blijkt uit histologische analyse, te recapituleren. Bovendien werden verhoogde elastinevezels en neovascularisatie waargenomen in de periferie van de graft. Daarom presenteert dit model een potentiële nieuwe techniek voor circumferential eesofageale reconstructie.
Introduction
De behandeling van slokdarmaandoeningen, zoals aangeboren misvormingen en slokdarmcarcinomen, kan leiden tot structureel segmentverlies van de slokdarm. In de meeste gevallen zijn autologe vervangende grafts uitgevoerd, zoals maagophaalleidingen of darminterposities,1,2. Echter, deze slokdarmvervangingen hebben een verscheidenheid aan chirurgische complicaties en heroperatie risico’s3. Zo kan het gebruik van weefsel-engineered slokdarm steigers nabootsen van de inheemse slokdarm een veelbelovende alternatieve strategie voor uiteindelijk regenereren verloren weefsels4,5,6.
Hoewel een weefsel-engineered slokdarm potentieel biedt een alternatief voor de huidige behandelingen van slokdarmafwijkingen, er zijn aanzienlijke barrières voor de in vivo toepassing. Postoperatieve anastomotische lekkage en necrose van de geïmplanteerde slokdarmsteiger leiden onvermijdelijk tot een dodelijke infectie van de omliggende aseptische ruimte, zoals het mediastinum7. Daarom is het uiterst belangrijk om voedsel- of speekselbesmetting in de wond en nasogastrische buis te voorkomen. Gastrostomie of intraveneuze voeding moet worden overwogen totdat de primaire wondgenezing is voltooid. Tot op heden, slokdarmweefsel engineering is uitgevoerd in grote diermodellen, omdat grote dieren kunnen alleen worden gevoed door intraveneuze hyperalimentatie gedurende 2-4 weken na implantatie van de steiger8. Een dergelijk niet-oraal voedingsmodel is echter niet vastgesteld voor vroegtijdige overleving na slokdarmtransplantatie bij kleine dieren. Dit komt omdat de dieren waren zeer actief en oncontroleerbaar, zodat ze niet konden houden van de voedingssonde in hun magen voor een langere periode van tijd. Om deze reden zijn er weinig gevallen van succesvolle slokdarmtransplantatie bij kleine dieren.
Gezien de omstandigheden van slokdarmweefseltechniek, ontwierpen we een tweelaags buisvormig schavot bestaande uit elektrogesponnen nanovezels (binnenlaag; Figuur 1A) en een 3D-geprinte streng (buitenlaag; Figuur 1B) met inbegrip van een gewijzigde gastrostomietechniek. De interne nanovezel is gemaakt van PU, een niet-afbreekbaar polymeer, en voorkomt de lekkage van voedsel en speeksel. De externe 3D-geprinte strengen zijn gemaakt van biologisch afbreekbare polycaprolacton (PCL), die mechanische flexibiliteit kan bieden en zich kan aanpassen aan peristaltische beweging. Menselijke vet-afgeleide mesenchymale stamcellen (hAD-MSCs) werden gezaaid op de binnenste laag van het schavot om re-epithelisatie te bevorderen. De nanovezelstructuur kan de initiële regeneratie van slijm vergemakkelijken door een structurele extracellulaire matrix (ECM) omgeving te bieden voor celmigratie.
We hebben ook de overlevingskans en de bioactiviteit van de ingeënte cellen verhoogd door middel van bioreactorteelt. De geïmplanteerde steiger was bedekt met een schildklier flap om meer stabiele regeneratie van de slokdarm slijmvlies en spierlaag mogelijk te maken. In dit rapport beschrijven we protocollen voor slokdarmweefseltechnieken, waaronder steigerproductie, mesenchymale stamcelgebaseerde bioreactorteelt, een bypassvoedingstechniek met gemodificeerde gastrostomie en een gemodificeerde chirurgische anastomose techniek voor circumferential slokdarmreconstructie in een rattenmodel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bestaande dierstudies over kunstmatige slokdarm worden nog steeds beperkt door verschillende kritische factoren. De ideale kunstmatige slokdarm steiger moet biocompatibel zijn en hebben uitstekende fysieke eigenschappen. Het moet in staat zijn om het mucosale epitheel in de vroege postoperatieve periode te regenereren om anastomotische lekkage te voorkomen. Regeneratie van de binnenste cirkelvormige en buitenste longitudinale spierlagen is ook belangrijk voor functionele peristalse12,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI16C0362) en Basic Science Research Programma via de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van Onderwijs (2017R1C1B2011132). De biospecimens en gegevens die in deze studie werden gebruikt, werden verstrekt door de Biobank van seoul National University Hospital, een lid van Korea Biobank Network.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
