Изоляция стволовых клеток от трехмерных сфероидных культур
Summary
Используя первичные эпителиальные клетки простаты человека, мы сообщаем о новом методе, свободном от биомаркеров функциональной характеристики стволовых клеток, спомощьив сфероидной этикетке- удержания. Пошаговым протоколом описывается для маркировки 2D, CFSE или Far Red 2D-клеток; трехмерное образование сфероидов; маркировка удерживающей стволовые клетки идентификации иммуноцитохимии; и изоляция от FACS.
Abstract
Несмотря на достижения в исследованиях стволовых клеток взрослых, выявление и изоляция стволовых клеток от образцов тканей остается серьезной проблемой. В то время как резидентные стволовые клетки относительно тихие с нишевыми удерживающими устройствами во взрослых тканях, они входят в клеточный цикл в трехмерной (3D) культуре и проходят как симметричное, так и асимметричное деление клеток, что приводит как к стеблю, так и к прародителю Клетки. Последние быстро размножаются и являются основной популяцией клеток на различных стадиях линии обязательств, образуя неоднородные сфероиды. С использованием первичных нормальных человеческих эпителиальных клеток простаты (HPrEC), сфероид основе, этикетки удержания асссбыл был разработан, что позволяет идентификации и функциональной изоляции сфероидов инициирующих стволовых клеток в одном разрешении клеток.
HPrEC или клеточные линии двухмерно (2D) культивируются с BrdU в течение 10 дней, чтобы позволить его включение в ДНК всех разделительных клеток, в том числе самообновляющихся стволовых клеток. Вымыть начинается после переноса в 3D-культуру на 5 дней, в течение которых стволовые клетки самообновляются через асимметричное деление и инициируют образование сфероидов. В то время как относительно тихие стволовые клетки дочери сохраняют родительскую ДНК, помеченную BrdU, потомки дочери быстро размножаются, теряя этикетку BrdU. BrdU можно заменить CFSE или Far Red pro-dyes, которые позволяют изоляцию стволовых клеток в реальном маштабе времени FACS. Характеристики стволовых клеток подтверждаются образованием сфероидов in vitro, анализами регенерации тканей in vivo и документированием их симметричных/асимметричных делений клеток. Изолированные этикетки удерживающих стволовых клеток могут быть тщательно допрошены вниз по течению молекулярных и биологических исследований, в том числе РНК-сек, ChIP-seq, одноклеточного захвата, метаболической активности, протеоме профилирования, иммуноцитохимии, органоидного образования, и in vivo ткани регенерации. Важно отметить, что этот подход, свободный от маркеров функциональной изоляции стволовых клеток, определяет стволовые клетки из свежих образцов рака и линии раковых клеток из нескольких органов, что свидетельствует о широкой применимости. Он может быть использован для выявления рака стволовых клеточных биомаркеров, экран фармацевтических препаратов ориентации рака стволовых клеток, и обнаружить новые терапевтические цели в раковых заболеваниях.
Introduction
Человеческая предстательная железа содержит светящийся эпителий с секреторной функцией и базальные клетки, лежащие в ее основе вместе с необычным нейроэндокринным компонентом клеток. Эпителиальные клетки, в этом случае, генерируются из редкой популяции стволовых клеток простаты, которые являются относительно затихи в vivo и выступать в качестве системы ремонта для поддержания железистого гомеостаза на протяжении всей жизни1. Несмотря на многие достижения, выявление и функциональная изоляция стволовых клеток простаты остается серьезной проблемой в этой области. Биомаркеры стволовых клеток, в том числе клеточной поверхности маркера на основе методологии в сочетании с цитометрией потока обычно используются для исследования стволовых клеток2,3,4. Тем не менее, результаты для обогащения и изоляции сильно различаются в зависимости от функции маркерных комбинаций и антитела специфичность5,6,поднимая вопросы о личности изолированных клеток. Другой широко используемый подход для стволовых, как обогащение клеток является трехмерной (3D) сфероидной культуры2,3,4. В то время как резидентов стволовых клеток относительно тихие in vivo с нишевыми ограничениями, они проходят деление клеток в 3D матричной культуры (как симметричные и асимметричные), генерации как стволовых и прародителей клеток, которые быстро размножаются к линии обязательств7,8. Сформированные сфероиды представляют собой разнородную смесь, содержащую как стволовые клетки, так и клетки-прародители на различных стадиях обязательств линии, включая клетки-прародители ранней и поздней стадии. Таким образом, анализы с использованием целых сфероидов не являются исключительными стволовыми клетками, что делает идентификацию уникальных свойств стволовых клеток неубедительной. Поэтому, очень важно создать анализы для выявления и отделения стволовых клеток простаты от их дочери-прародителей. С этой целью цель нынешнего протокола заключается в создании системы анализа, которая позволяет эффективно выявлять и изоляцию стволовых клеток из тканей предстательной железы человека с последующим тщательным анализом их биологических функций.
Долгосрочный 5-бромо-2′-deoxyuridine (BrdU) этикетка-удержание широко используется для in vivo и in vitro lineage отслеживания стволовых клеток на основе их длительного удвоения времени9,10. Нынешний подход к идентификации и изоляции стволовых клеток простаты, описанный в настоящем документе, основан на их относительных тихих характеристиках и свойствах удержания этике в смешанной эпителиальной популяции. Кроме того, на основе гипотезы бессмертной нити ДНК, только стволовые клетки могут пройти асимметричное деление клеток. Стволовая клетка представляет собой дочернюю клетку, которая содержит более старую родительскую ДНК, в то время как клетка-прародитель, которая является клеткой-приверженной дочерью, получает недавно синтезированную ДНК. Уникальное свойство стволовых клеток, описанное выше, используется для выполнения маркировки BrdU в родительских стволовых клетках в первичных культурах, а затем отслеживать их этикетку после BrdU-вымывания при переходе к 3D-безякорной культуре сфероидов. В то время как большинство первичных эпителиальных клеток простаты сохраняют базальный и транзитный усиливающий фенотип в 2D-культуре, есть также редкая популяция многопотентных стволовых клеток, пополняя и поддерживая эпителиальный гомеостаз, о чем свидетельствует образование сфероидов или полностью дифференцированных органоидов с соответствующими культурами при передаче в 3D-системы3,12. В нашем текущем протоколе, с помощью HPrEC простаты сфероидов или простасфера основе BrdU, CFSE, или Дальнекрасный удержания анализы следуют флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), мы определяем этикетки удерживающих стволовых клеток в сфероидов на уровне одной клетки13.
Важно отметить, что мы также подтвердили характеристики стволовых клеток клеток, удерживающих этикетку в сфероидах на ранней стадии, по сравнению с клетками-прародителями с родословной. К ним относятся асимметричное деление стволовых клеток, способность образования сфероидов in vitro и способность регенерации тканей in vivo, повышенная аутофагия, увеличенный биогенеза рибосомы и снижение метаболической активности. Впоследствии был проведен анализ РНАЗЕКа. По дифференциально выраженные гены в сфероидных клетках, сохраняющих этикетку, были замечены, которые могут служить новыми биомаркерами для стволовых клеток простаты человека. Этот сфероид на основе этикетки удерживая подход может применяться к образцам рака аналогичным образом определить небольшое количество раковых стволовых клеток, тем самым обеспечивая переводческие возможности для управления терапевтической резистентной популяции13. Ниже представлен prostasphere основе этикетки удержания асссс использованием основных эпителиальных клеток простаты человека (HPrEC) в качестве примера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цитометрия потока с использованием нескольких маркеров поверхности стволовых клеток является широко используемым подходом для исследования стволовых клеток, несмотря на отсутствие как специфичности, так и избирательности1,5,6. В то в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национального института рака R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Мы благодарим Flow Cytometry Core в Университете Иллинойса в Чикаго за помощь в сортировке клеток.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. 암 연구학. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. 암 연구학. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
