Isolering af Stem-lignende celler fra 3-dimensionelle sfæriske kulturer

Summary

Ved hjælp af humane primære prostata epiteliale celler, rapporterer vi en roman biomarkør-fri metode til funktionel karakterisering af Stem-lignende celler ved en spheroid-baseret etiket-retention assay. En trin-for-trin-protokol er beskrevet for BrdU, CFSE eller langt rødt 2D-celle mærkning; tredimensionel sfærisk dannelse; etiket-fastholde Stem-lignende celle identifikation ved immunocytochemistry; og isolation af FACS.

Abstract

Trods fremskridt inden for forskning i voksne stamceller er identifikation og isolering af stamcellerne fra vævsprøver fortsat en stor udfordring. Mens residente stamceller er relativt latent med niche begrænsninger i voksent væv, kommer de ind i cellecyklussen i anker-fri tredimensionel (3D) kultur og gennemgår både symmetrisk og asymmetrisk celledeling, hvilket giver anledning til både Stam-og progenitorceller Celler. Sidstnævnte prolifererer hurtigt og er den største cellepopulation på forskellige stadier af Lineage engagement, danner heterogene sfæroider. Ved hjælp af primære normale humane prostata epiteliale celler (HPrEC), en spheroid-baseret, etiket-retention assay blev udviklet, der tillader identifikation og funktionel isolering af spheroid-initierende stamceller ved en enkelt celle opløsning.

HPrEC eller cellelinjer er to-dimensionelt (2D) kultiveret med BrdU i 10 dage for at tillade dets inkorporering i DNA af alle skille celler, herunder selvfornyende stamceller. Skyl ud begynder ved overførsel til 3D-kulturen i 5 dage, hvor stamceller selv fornyer gennem asymmetrisk division og initierer sfærisk dannelse. Mens relativt latent datter stamceller bevarer brdu-mærket forældrenes DNA, er datter forfædre hurtigt prolifererende, mister brdu etiketten. BrdU kan erstattes med CFSE eller langt røde Pro-farvestoffer, som tillader levende stamcelle isolation af FACS. Stamcelle egenskaberne bekræftes ved in vitro-sfærisk dannelse, in vivo-vævs regenererings analyser og ved at dokumentere deres symmetriske/asymmetriske celle opdelinger. De isolerede etiket-holde stamceller kan blive nøje afhørt af downstream-molekylære og biologiske undersøgelser, herunder RNA-SEQ, ChIP-SEQ, enkelt celle opsamling, metabolisk aktivitet, proteom profilering, immunocytokemi, organoid dannelse og in vivo vævsregenerering. Det er vigtigt, at denne markør frie funktionelle stamcelle isolations tilgang identificerer Stam lignende celler fra friske kræft prøver og kræft cellelinjer fra flere organer, hvilket tyder på bred anvendelighed. Det kan bruges til at identificere kræft stamme-lignende celle biomarkører, skærm lægemidler rettet mod kræft Stem-lignende celler, og opdage nye terapeutiske mål i kræft.

Introduction

Den menneskelige prostata indeholder luminale epitel med sekretoriske funktion og basal celler underliggende det sammen med en usædvanlig neuroendokrine celle komponent. Epitelcellerne, i dette tilfælde, er genereret fra en sjælden population af prostata stamceller, der er relativt latent in vivo og fungere som et reparationssystem til at opretholde glandulær homøostase hele livet¹. Trods mange fremskridt er identifikationen og den funktionelle isolation af prostata stamceller fortsat en stor udfordring i marken. Stamcelle-biomarkører, herunder celleoverflade markerings baserede metoder kombineret med flowcytometri, anvendes almindeligvis til stamcelleforskning^2,3,4. Men, resultater for tilsætning og isolation varierer meget som en funktion af markør kombinationer og antistof specificitet^5,6, at rejse spørgsmål om identiteten af de isolerede celler. En anden meget udbredt tilgang til Stem-lignende celle berigelse er tredimensionel (3D) sfærisk kultur^2,3,4. Mens residente stamceller er relativt latent in vivo med niche begrænsninger, gennemgår de celle opdeling i 3D Matrix kultur (både symmetrisk og asymmetrisk), genererer både stamceller og progenitorcellerne, der hurtigt gengiver mod Lineage engagement^7,8. De dannede sfæroider er en heterogen blanding, der indeholder både stamceller og progenitorceller på forskellige stadier af lineært engagement, herunder tidlige og sene progenitorceller. Således er assays ved hjælp af hele sfæroider ikke stamcelle eksklusiv, hvilket gør identifikationen af unikke stamcelle egenskaber inkonklusive. Derfor er det afgørende at skabe assays at identificere og adskille prostata stamceller fra deres datter forfædre. Med henblik herpå er målet med den nuværende protokol at etablere et analyse system, der giver mulighed for effektiv identifikation og isolering af stamceller fra humant prostata væv efterfulgt af en robust downstream-analyse af deres biologiske funktioner.

Langsigtet 5-Bromo-2′-deoxyuridin (brdu) etiket-retention er meget udbredt til in vivo og in vitro-Lineage sporing af stamceller baseret på deres langvarige fordoblings tiden^9,10. Den nuværende fremgangsmåde for identifikation og isolering af prostata stamceller er baseret på deres relative, karakteristiske og mærkelige egenskaber i en blandet epitelial population. Desuden er det kun stamceller, som er baseret på den udødelige streng DNA-hypotese, som kan gennemgå asymmetrisk celledeling. Stam cellen repræsenterer den datter celle, der indeholder det ældre forældre-DNA, mens progenitorcellen, som er en engageret datter celle, modtager det nyligt syntetiserede DNA. Den unikke stamcelle egenskab, der er beskrevet ovenfor, udnyttes til at udføre brdu-mærkning i forældre stamceller i primære kulturer og derefter spore deres etiket efter brdu-washout ved overførsel til 3D Anchor-fri sfæroide-kultur. Mens størstedelen af primære prostata epiteliale celler bevarer en basal og transit forstærker fænotype i 2D-kultur, er der også en sjælden population af Multipotente stamceller, som genopfylder og vedligeholder epitelial homøostase som det fremgår af dannelsen af sfæroider eller fuldt differentierede organoider med tilsvarende dyrkningsmedier ved overførsel til 3D-systemer^3,12. I vores nuværende protokol, ved hjælp af HPrEC prostata sfæroider eller prostasphere-baserede BrdU, CFSE, eller langt røde retention assays efterfulgt af fluorescens aktiverede celle sortering (FACS), identificerer vi etiket-fastholdelse stamceller i sfæroider på et enkelt celleniveau¹³.

Det er vigtigt, at vi yderligere bekræftede stamcelle egenskaberne for etiket bevarende celler i tidlige stadier af sfæroider sammenlignet med progenitorcellerne med lineært engagement. Disse omfatter stamcelle asymmetrisk division, in vitro sfærisk dannelse evne og in vivo vævsregenerering kapacitet, forhøjet autophagy aktivitet, Augmented ribosom Biogenese og nedsat metabolisk aktivitet. Efterfølgende blev der udført RNAseq-analyse. Differentielt udtrykte gener i etiket-fastholdelse sfæide celler blev observeret, der kan tjene som nye biomarkører for humane prostata stamceller. Denne spheroid-baserede etiket-fastholdelse tilgang kan gælde for kræft prøver til tilsvarende identificere et lille antal kræft stamceller, hvilket giver translationelle muligheder for at forvalte de terapeutiske resistente populationer¹³. Præsenteret nedenfor er prostasphere-baseret etiket-retention assay ved hjælp af humane primære prostata epiteliale celler (HPrEC) som et eksempel.

Protocol

Alle celle håndterings-og medie præparater skal udføres med aseptisk teknik i et biologisk sikkerhedskabinet i klasse II. 1. kultur og vedligeholdelse af HPrEC-celler i 2D Coat 100 mm kultur retter med 2 ml 2,5 μg/cm2 fibronektin opløsning natten over ved stuetemperatur (RT). Aspirer opløsningen og lad kultur retterne lufttørre i BSC for 45 min. Fibronectin-belagte kultur retter kan opbevares 2 – 4 uger ved 4 °C. Tilsæt 9 mL prostata epitel cellevækst…

Representative Results

Primære normale humane prostata epiteliale celler er placeret i fibronectin-coated kultur retter og cellevækst vedligeholdes i 2D kultur (figur 1a). Ved overførsel til 3D-kultur med en kælder membran matrix, er differentierede epiteliale celler langsomt uddø. Kun prostata stamceller kan overleve i en anker-fri kultur og danne sfæroider i 5 dage (figur 1b). Dobbelt mærkning af prostata epitelial…

Discussion

Flow cytometri ved hjælp af flere stamcelle overflade markører er en almindeligt anvendt tilgang til stamcelleforskning trods manglende både specificitet og selektivitet^1,5,6. Mens sfæroide dannelse i et 3D-kultur system er en anden nyttig metode til at berige den sjældne stamcelle population fra primære epitelceller, herunder hprec, er de resulterende sfæroider stadig en heterogen blanding af Stam-og progenitorceller<sup…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
1 mL tuberculin syringes	Bectin Dickinson	BD 309625
1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile
100 mm culture dishes	Corning/Falcon	353003
12-well culture plate	Corning/Falcon	353043
15 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352097
22 x 22 mm coverslips, sq	Corning	284522	For MatTek 35 mm culture dish
24 x 50 mm coverslips	Corning	2975245
26G x 1.5 inch hypodermic needle	Monoject	1188826112
2N HCl
35 mm culture dish with cover glass bottom	MatTek Corp	P35G-0-10-C	Glass bottom No. 0, uncoated, irradiated
40 µm pore nylon cell strainer	Corning	352340
5% CO2 culture incubator, 37 °C	Forma
50 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352098
5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap	Corning	352235	35 µm nylon mesh
6-well culture plates	Corning	353046
8-well chamber slides	Millipore Sigma	PEZGS0816
Aqueous mounting medium containing DAPI	Vector Laboratories	H-1200	A nuclear fluorescent dye
Biological safety cabinet, Level 2 certified
BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine)	Sigma-Aldrich	B5002	1 mM stock solution in DMSO
Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf
Centrifuge for 15 mL tubes	Beckman Coulter		Allegra 6
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)	Thermo Fisher Scientific	C34554	5 mM stock solution in DMSO
cytochalasin D	Thermo Fisher Scientific	PHZ1063
Dispase 1U/mL	StemCell Technologies	07923
FACS CellSorter MoFlo XDP	Beckman Coulter	s
Far-Red pro-dye	Thermo Fisher	C34564	5 mM stock solution in DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	For coating 100 mm culture dishes
Fluorescent microscope with color digital camera	Carl Zeiss		Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11029
HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)	Lifeline Cell Technology	FC-0038	Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen
ice bucket and ice
Inverted microsope with digital camera
Matrigel, low growth factor, phenol-red free	Corning	356239
Methanol	Corning	A452-4
Mouse anti-BrdU antibody	Cell Signaling	5292S
Mouse IgG antibody (negative control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Pipettors and tips, various sizes
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)	Lifeline Cell Technology	LL-0041
Propidium Iodide (PI)	R & D Systems	5135/10	10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark
Serological pipets, various sizes
Software for sphere counting and size measurements
Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Water bath, 37 °C
z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope